Management delle risorse microbiotiche per la produzione di vini tipici pugliesi

La fermentazione del succo d’uva è un processo biochimico complesso, in cui i lieviti svolgono un ruolo fondamentale trasformando gli zuccheri dell’uva in etanolo, CO2 e altre centinaia di composti secondari. L’ecologia dei lieviti, responsabili della fermentazione alcolica, risulta essere più complessa rispetto a quanto precedentemente pensato, dimostrando inoltre che i lieviti non-Saccharomyces svolgono un ruolo rilevante sull’impatto metabolico e la complessità aromatica del prodotto finito. L’inclusione di lieviti vinari non-Saccharomyces, insieme a ceppi di Saccharomyces in multi-starter per la fermentazione alcolica è stato proposto come strumento per migliorare la composizione chimica e le proprietà sensoriali del vino, traendo vantaggio dalle fermentazioni spontanee ed evitando il rischio di arresti fermentativi. SCOPO DEL LAVORO L’obiettivo principale di questo lavoro è stato di isolare ceppi microbici (lieviti e batteri) rappresentanti la biodiversità della microflora “virtuosa” dei vini tipici pugliesi studiati. MATERIALI E METODI Lieviti e batteri sono stati isolati da fermentazioni spontanee di vini Pugliesi e da bucce d’uva. L’identificazione dei lieviti è stata ottenuta mediante analisi di restrizione e sequenziamento della regione compresa fra gli internal transcribed spacers e la frazione 5.8S del RNA ribosomiale (5.8S-ITS), inoltre i ceppi di Saccharomyces cerevisiae sono stati identificati mediante PCR specie-specifici e caratterizzati genotipicamente con l’analisi delle sequenze interdelta. La caratterizzazione tecnologica dei ceppi selezionati di S. cerevisiae e non-Saccharomyces è stata condotta con in vitro, mediante un tradizionale approccio polifasico, e in vivo. Inoltre è stata investigate la biodiversità dei ceppi di O. oeni isolati da vini in cui era in corso la fermentazione malolattica spontanea. In particolare si è deciso di focalizzare l’attenzione sulla biodiversità genetica e sulla diversa capacità di degradare l’acido malico. Per la caratterizzazione genotipica sono state utilizzate due tecniche molecolari: l’analisi variable number tandem repeat (VNTR) e l’analisi Multilocus Sequence typing (MLST). Due ceppi di S. cerevisiae (S. cerevisiae I6 e S. cerevisiae E4) sono stati selezionati per le loro proprietà fermentative per successive esperimenti di microvinificazione, i batteri sono stati inoculati con due diversi tempi di inoculo, insieme al lievito (coinoculo) o alla fine della fermentazione alcolica (inoculo sequenziale). RISULTATI Fra i ceppi isolati ed identificati è stata osservata una grande biodiversità di ceppi di interesse enologico, infatti sono stati identificati ceppi di H. uvarum, C. stellata, S. cerevisiae e M. pulcherrima. In particolare la maggior parte dei ceppi analizzati appartengono ai generi M. pulcherrima e H. uvarum. Il primo step della caratterizzazione tecnologica (attività killer, produzione di H2S, cinetiche di fermentazione in terreno sintetico e mosto, analisi citofluorometriche) ci ha permesso di selezionare i ceppi di lieviti più promettenti, sia ceppi di S. cerevisiae che non-Saccharomyces, fra questi ultimi la maggior parte dei ceppi analizzati appartengono alle specie Hanseniaspora e Candida. Inoltre ci ha permesso di valutare le performances di starter multi-strain (Sacch-non-Sacch). Tuttavia, utilizzando due classiche strategie di inoculo, pianificate per promuovere l'espressione dei ceppi non-Saccharomyces, è stata notata una forte competizione fra i ceppi di S. cerevisiae e i non-Saccharomyces, compromettendo l’efficienza della fermentazione alcolica. L’analisi PCR delle sequenze di S. cerevisiae ha mostrato una grande biodiversità, permettendo di distinguere 86 diversi biotipi su 90 ceppi analizzati. Sono stati analizzati 50 ceppi di O. oeni, isolati da diversi vini, fra questi 50 ceppi la tecnica VNTR ha permesso di distinguere 31 profili differenti, di cui 11 profili unici, mentre i 20 ceppi analizzati con la tecnica MLST sono stati differenziati in 8 diversi ST, di cui 6 nuovi. Diversi risultati relativi all'efficienza della FML sono stati osservati utilizzando diverse coppie di lieviti e batteri. Per esempio, alcuni ceppi di O. oeni hanno portato ad una fermentazione malolattica più efficiente quando coinoculati con S. cerevisiae I6, mentre altri O. oeni hanno svolto una fermentazione malolattica migliore se utilizzati con S. cerevisiae E4. In generale, i risultati ottenuti permetteranno di gestire al meglio le risorse microbiche per la produzione di vini tipici pugliesi.