Transglutaminase, nutrition and human health

Background: transglutaminases (TGase) are a class of enzymes widely spread in eukaryotic and prokaryotic organisms. Enzymes of this family catalyze post-translational modifications in many proteins by acyl transfer reactions, deamidation and crosslinking (polymerisation) between protein intra- or inter-chain glutamine (acyl donor) and lysine (acyl acceptor) peptide residues. Due to its facility of expression and purification, the only TGase enzyme widely used for industrial applications is the microbial TGase extracted from Streptomyces mobaraensis (MTGase). Nowadays the MTGase is commercially available and widely used in biopolymers industry, in cosmetics, in clinical applications, in wool textiles, and above all in the food processing industry. Its ability to catalyze crosslinks on many different protein substrates is increasingly used not only for sausage, ham and cheese production but, very recently, also for flour detoxification, as a possible alternative therapy to the gluten free diet. It follows that nowadays the industrial applications of MTGase have increased, covering more and more fields producing a very active scientific research about this topic aimed at attempt to meet specific industrial needs, as the implementation of more efficient system for MTGase production, the research of alternative sources of microbial TGase, and safe source of recombinant enzymes. Aims of the doctorate project: the main aim of the project is the identification of novel forms of microbial TGases that could become an alternative to that in use. A depth screening of known sequences has been performed, with the aim of obtaining a classification of microbial TGases for their similarity to known forms. To select the best candidates to be active forms under appropriate conditions, molecular modelling and molecular simulations have been performed on selected sequences. To test the enzymatic activity, experimental assays have been performed with a novel form, and another novel form has been expressed. Results: the present work proposes at first an analysis, lacking so far, of the wide microbial transglutaminase world, developing the first classification of the microbial TGase based on their sequence features and their specific predicted secondary structures. In order to classify and analyze the structural features of all the sequences annotated as having a TGase core computational techniques involving sequence analyses, comparative studies, building of phylogenetic trees, homology models and molecular dynamic simulations have been used. From this approach, a preliminary classification of these sequences was done by dividing them in five main groups. Each group has been investigated from the sequence point of view to analyze the presence of specific motifs. For three of this five groups, also the secondary structures have been investigated and, from this analysis, features specific for each group have been detected. Moreover, two novel forms of microbial TGase (mTGase) have been investigated in the detail: K. albida mTGase and the hypothetical mTGase from SaNDy (organism not disclosed for patent opportunity). Molecular dynamics simulations and active site pocket analyses have been performed for the first, in comparison with MTGase. For the second, instead, experimental technique has been used to purify the hypothetical enzyme in order to test it on food related substrates. Experimental assays on both the proteins are still ongoing, to find the best enzymatic activity conditions and the best substrates of reaction. The molecular dynamic simulations performed on K. albida mTGase have suggested some explanations to the higher specificity of this enzyme than MTGase, experimentally demonstrated by Steffen et colleague, and several indications to change the activity conditions used to test it. Moreover, the substrates screening has allowed to find novel possible substrates, on which this enzyme could be employed for the allergenicity reduction. On the other hand, the enzyme extracted from SaNDy, showing a higher similarity with MTGase, could be less selective than K. albida mTGase for specific substrates, so it could be possible its application also on the gliadin substrate, but to prove it further experiments are necessary. Note: the present PhD work has been mainly performed in the Bioinformatics Laboratory at the CNR of Avellino under Dr. Facchiano’s supervision, however all the MD simulations have been performed at the Biochemistry Department of the University of Zurich, in the computational and structural biology laboratory under the supervision of Prof. A. Caflisch and his research group (compulsory abroad training period). Experimental activity assays on gliadin substrate have been performed by the spectrometry mass CeSMA-ProBio lab at the CNR of Avellino; and the hypothetical mTGase from SaNDy was instead cloned, expressed and purified in collaboration with the Laboratory for Molecular Sensing at the CNR of Avellino.

Conoscenze preesistenti: Le transglutaminasi (TGase) sono una classe di enzimi ampiamente diffusa tra gli organismi procarioti ed eucarioti. Gli enzimi di questa famiglia catalizzano modifiche post-traduzionali in molte proteine attraverso reazioni di trasferimento dell’acile, reazioni di deaminazione e di crosslinking (polimerizzazione) tra residui peptidici di lisina (accettore di acile) e glutammina (donatore di acile) intra- o inter-catena proteica. A causa della sua facilità di espressione e di purificazione, l’unica TGase ampiamente usata per le applicazioni industriali è la TGase microbica estratta da Streptomyces mobaraensis (MTGase). Oggigiorno la MTGase è disponibile in commercio ed è ampiamente usata nell’industria dei biopolimeri, in cosmetica, per applicazioni cliniche, nell’industria tessile della lana e soprattutto nell’industria alimentare. La sua abilità di catalizzare legami crociati in molti substrati proteici differenti è sempre più usata non solo per la produzione di salsicce, prosciutti e formaggi ma, molto recentemente, anche per la detossificazione della farina, come possibile terapia alternativa alla dieta senza glutine. Ne consegue che oggigiorno le applicazioni industriali della MTGase stiano aumentando, coinvolgendo sempre più settori e producendo una ricerca scientifica su questo argomento sempre più fervente, allo scopo di tentare di rispondere a specifiche esigenze industriali, come l’implementazione di sistemi di purificazione della MTGase più efficienti, la ricerca di fonti alternative di transglutaminasi microbica, e di fonti sicure di enzimi ricombinanti. Scopo del progetto di dottorato: lo scopo principale del progetto è l’identificazione di nuove forme di transglutaminasi microbica che possano diventare un’alternativa a quella attualmente in uso. È stata eseguita un’analisi approfondita delle sequenze note allo scopo di ottenere una classificazione delle TGase microbiche attraverso la loro similarità a forme note. Per selezionare le migliori candidate che possano essere forme attive in appropriate condizioni, le sequenze selezionate sono state soggette di modellamento molecolare e simulazioni molecolari. Per testare l’attività enzimatica, sono stati effettuati dei saggi sperimentali su una nuova forma trovata ed un’ulteriore nuova forma è stata espressa. Risultati: il presente lavoro propone in primo luogo un’analisi, ad oggi assente, dell’ampio panorama delle transglutaminasi microbiche, sviluppando la prima classificazione delle TGase microbiche basata sulle loro caratteristiche di sequenza e sulle loro specifiche strutture secondarie predette. Al fine di classificare ed analizzare le caratteristiche strutturali di tutte le sequenze annotate come aventi un TGase core, sono state utilizzate tecniche computazionali che coinvolgono analisi di sequenza, studi comparativi, costruzione di alberi filogenetici, modellamento per omologia e simulazioni di dinamica molecolare. Tramite questo approccio, è stata effettuata una classificazione preliminare di queste sequenze dividendole in cinque gruppi principali. Ogni gruppo è stato studiato dal punto di vista delle sequenze per analizzare la presenza di motifs specifici. Per tre di questi cinque gruppi, sono state studiate anche le strutture secondarie e, da questa analisi, sono state rilevate caratteristiche specifiche per ogni gruppo. Inoltre, due nuove forme di TGase microbica (mTGase) sono state studiate in dettaglio: K. albida mTGase e l’ipotetica mTGase da SaNDy (organismo non rivelato per possibilità di brevetto). Per la prima, in comparazione con la MTGase, sono state effettuate analisi della tasca relativa al sito attivo e simulazioni di dinamica molecolare. Per la seconda, invece, sono state utilizzate tecniche sperimentali per purificare l’ipotetico enzima al fine di testarne l’attività su substrati alimentari. Saggi sperimentali su entrambe le proteine sono ancora in corso, al fine di trovare le migliori condizioni di attività enzimatica e i migliori substrati di reazione. Le simulazioni di dinamica molecolare eseguite sulla mTGase di K. albida hanno suggerito alcune spiegazioni alla maggiore specificità di questo enzima rispetto alla MTGase, dimostrata sperimentalmente da Steffan e colleghi, ed alcune indicazioni per variare le condizioni di attività usate per testarla. Inoltre, l’analisi dei substrati ha permesso di trovare nuovi possibili substrati, sui quali l’enzima potrebbe essere impiegato ai fini della riduzione delle allergenicità. D’altro canto, l’enzima estratto da SaNDy, mostrando una più alta somiglianza con la MTGase, potrebbe essere meno selettivo della mTGase da K. albida nei confronti di specifici substrati, pertanto potrebbe essere possibile una sua applicazione anche su substrati gliadinici, tuttavia, per provare ciò, sono necessari ulteriori esperimenti. Note: il presente lavoro di dottorato è stato principalmente svolto presso il Laboratorio di Bioinformatica del CNR di Avellino sotto la supervisione del Dr. Facchiano, tuttavia, tutte le simulazioni di dinamica molecolare sono state eseguite presso il Dipartimento di Biochimica dell’Università di Zurigo, nel laboratorio di biologia strutturale e computazionale sotto la supervisione del Prof. A. Caflisch e del suo gruppo di ricerca (periodo di formazione all’estero obbligatorio). I saggi di attività sperimentale sul substrato gliadinico sono stati effettuati dal laboratorio di spettrometria di massa CeSMA-ProBio presso il CNR di Avellino; e l’ipotetica mTGase da SaNDy è stata invece clonata, espressa e purificata durante la collaborazione con il laboratorio di Molecular Sensing presso il CNR of Avellino.