Toxigenic profile of fungi and multi mycotoxins analysis as supporting tools for a risk evaluation and mycotoxins minimization/degradation

Mycotoxins are secondary metabolites produced by certain filamentous fungi, which can contaminate crop plants or stored food and feed; among them the most important mycotoxigenic fungi involved in food contamination, belong to three genera: Aspergillus, Fusarium and Penicillium. More than 300 mycotoxins have been identified and these secondary metabolites can be harmful to human and animal health when ingested (Bennett and Klich, 2003). Main mycotoxins contaminant in food and feed are: aflatoxins, ochratoxins, fumonisins, trichothecenes and zearalenone. Aflatoxins represent the most important class of mycotoxins, commonly found in maize and other cereals, the main fungi responsible for their production are Aspergillus flavus and A. parasiticus (Shepard, 2008). Instead grains, coffee, cocoa, wine, beer, and foods from animal origin are often contaminated by ochratoxin A, that is mainly produced by A. ochraceus (Van der Merwe et al., 1965), A. carbonarius, Penicillium verrucosum and P. nordicum. Fusarium verticillioides and F. proliferatum produce fumonisins, which are often detected in maize and by-products (Dutton, 1996). Trichothecenes, which are often found in cereal grains, in particular in wheat and maize, are divided in four groups, the principal two groups are: type-A with T2 and HT-2 toxin, produced by F. langhsetiae and F. sporotrichioides (Van der Fels-Klerk and Stratakou, 2010); Type-B with deoxynivalenol (DON) and nivalenol (NIV) produced by F. graminearum and F. culmorum (Placinta et al., 1999; Turner, 2010). Moreover, DON contamination is frequently found in association with another mycotoxin produced by the same fungi, zearalenone (ZEA) (Logrieco et al., 2002a). These species are responsible for infections occurring both in the field and during postharvest storage, particularly when cereals are stored under inappropriate conditions (e.g. high temperatures and high humidity). A large variety of toxic effects in animals and humans has been observed due to the ingestion of food contaminated with mycotoxins, such as: immunosuppression, carcinogenic, genotoxic, teratogenic or mutagenic effects (Peraica et al., 1999; Richard, 2007). Mycotoxin contamination became a public health concern with serious economical and ethical implications. Since it is not completely possible to prevent the synthesis of mycotoxins, national and international authorities have adopted regulatory limits and guidelines to monitor mycotoxin levels in various food and feed products (EC 2006a and 2006b; Commission Recommendation 2013/165/UE). Different physical, chemical and biological methods have been recommended for detoxification of food and feed contaminated by mycotoxins. Nevertheless, only a few of them have been accepted for practical use. A lot of specialists think that the best approach for mycotoxin decontamination should be the biological degradation, giving the possibility to remove mycotoxins under mild conditions, without using harmful chemicals and without significant losses in nutritive value and palatability of detoxified food or feed. Depending on their mode of action, these feed additives may act either by binding mycotoxins to their surface (adsorption), or by degrading or transforming them into less toxic metabolites (biotransformation). The binder efficacy of these substances is based on the properties of both the binder and the mycotoxin. Biotransformation can be achieved by mycotoxin-degrading enzymes or by microorganisms (fungi and bacteria) producing such enzymes. Various inorganic adsorbents, aluminosilicate and activated carbons, have been tested and used as mycotoxins binders (MB). An interesting alternative to inorganic adsorbents for the detoxification of mycotoxins is the use of organic binders, such as, cell wall components of yeast, lactic acid bacteria, conidia of Aspergilli. These MB are used to feed animal diet in order to reduce the absorption of mycotoxins from the gastrointestinal tract and their distribution to blood and target organs, thus preventing or reducing mycotoxicosis in livestock. Recently, the use of such substances as technological feed additives has been officially allowed in the European Union (Commission Regulation 2015/786). Ligninolytic enzymes, such as laccase, from white-rot fungi, as Pleurotus spp. catalyzed the oxidation of a broad number of phenolic compounds and aromatic amines by using molecular oxygen as the electron acceptor, which is then reduced to water (Reinhammar and Malstrom, 1981). Adding the appropriate redox mediator to the reaction can extend the activity of the laccase enzymes to nonphenolic substrates, such as mycotoxins. This PhD thesis is organized into six chapters and one annex, where the following tasks are described. In Chapter 1, one hundred and seventy-five wheat samples were collected during the growing seasons: 2013-2014, 2014-2015 and 2015-2016 in different Italian regions. Trichothecenes (DON, NIV, HT-2 and T2 toxins) and ZEA levels were monitored through the use of validated analytical methods, to provide an overview of the Italian distribution of mycotoxins in wheat. The Fusarium species isolated from the kernels were identified, based on their morphological characteristics. In Chapter 2, the development of an innovative technology for the bioremediation of AfB1-contaminated maize and its bioconversion into high nutritional feed, was realized through the exploitation of the degradative capability of Pleurotus eryngii. For this purpose, the AfB1–degradative activity of a crude enzymatic extract from a spent substrate and the ability of the white-rot and edible fungus P. eryngii to degrade AfB1 both in vitro and in a laboratory-scale mushroom cultivation, were investigated. In Chapter 3, the power of ground not-viable mycelium of P. eryngii (ITEM 13681) to absorb AfB1, was assessed. The influence of different parameters: pH (5, 7), AfB1 concentrations (50 and 1000 ng/mL), time (30 and 120 min), temperature (25 and 37°C), fungal mass (50 and 1000 mg), on the absorption capability of the mycelium of P. eryngii. were evaluated. Binding stability of AfB1-biosorbent and desorption studies were carried out varying, respectively, the pH to 7 and 3, for 24 hours of incubation at room temperature in the dark. In Chapter 4, the degradation activity of two laccases from two edible fungi (P. eryngii and P. pulmonarius) towards AfB1, AfM1, FB1, ZEA and T2 toxin, were evaluated separately, adding to the reaction natural and artificial mediators. The effect of laccase-mediator systems (LMSs) were analyzed by liquid chromatography with specific detector, based on the chemical feature of each single toxin. In Chapter 5, the aim pursued was to investigate the action of LMSs toward multiple toxins. For this purpose, several degradation assays were performed, screening the effect of different mediators, as acetosyringone (AS), syringaldehyde (SA), and synthetic mediator as 2,2,6,6-tetramethyl-piperidinyloxyl (TEMPO), on the activity of laccase from Trametes versicolor (EC 1.10.3.2) towards fusaric acid (FA) and mycotoxins, such as: DON, T2, FB1, AfB1, OTA and ZEA. A multi mycotoxin method, was set up to simultaneously screen these seven toxins, by liquid chromatography/tandem mass spectrometry (LCMS/ MS). In Chapter 6, the biodegrading activity of laccases enzymes towards ZEA has been further investigated. The degradation products were monitored by liquid chromatography–high resolution mass spectrometry (LC-HRMS). Data were processed by MassHunter Workstation Software (Qualitative Analysis Navigator and Qualitative Analysis Workflow, version B.08.00), Mass Profile Professional (version 14.08) and MassHunter Molecular Structure Correlator (version B.08.00)) from Agilent Technologies, to allow their identification. In Annex A, the Enniatins (A, A1, B and B1) and Beauvericin production from various Fusarium spp. were measured by ultra-performance liquid chromatography coupled with photodiode array and single quadrupole mass spectrometer (UPLC-PDA-QDa).

Le micotossine sono metaboliti secondari prodotti da alcuni funghi filamentosi, che possono contaminare piante coltivate o alimenti e mangimi immagazzinati; tra questi i più importanti funghi micotossigeni coinvolti nella contaminazione alimentare, appartengono a tre generi: Aspergillus, Fusarium e Penicillium. Più di 300 micotossine sono state identificate e questi metaboliti secondari possono essere dannosi per la salute umana ed animale quando ingeriti (Bennett and Klich, 2003). Le principali micotossine contaminati di alimenti e mangimi sono: aflatossine, ocratossina, fumonisine, tricoteceni e zearalenone. Le aflatossine rappresentano la classe più importante di micotossine, comunemente presenti nel mais e in altri cereali, i principali funghi responsabili della loro produzione sono Aspergillus flavus e A. parasiticus (Shepard, 2008). Invece i cereali, il caffè, il cacao, il vino, la birra e gli alimenti di origine animale sono spesso contaminati dall'ocratossina A, prodotta principalmente da A. ochraceus (Van der Merwe et al., 1965), A. carbonarius, Penicillium verrucosum e P. nordicum. Fusarium verticillioides e F. proliferatum producono fumonisine, che sono spesso rilevate nel mais e nei sottoprodotti (Dutton, 1996). I trichoteceni, che si trovano spesso nei cereali, in particolare nel frumento e nel mais, sono divisi in quattro gruppi, i due principali sono: il tipo A con le tossine T2 e HT-2, prodotte da F. langhsetiae e F. sporotrichioides (Van der Fels-Klerk e Stratakou, 2010); il tipo B con il deossinivalenolo (DON) e il nivalenolo (NIV) prodotti da F. graminearum e F. culmorum (Placinta et al., 1999; Turner, 2010). Inoltre, la contaminazione da DON si trova frequentemente in associazione con un'altra micotossina prodotta dagli stessi funghi, lo zearalenone (ZEA) (Logrieco et al., 2002a). Queste specie sono responsabili di infezioni che si verificano sia nel campo che durante la conservazione post-raccolta, in particolare quando i cereali sono immagazzinati in condizioni inadeguate (ad esempio alte temperature e alta umidità). Una grande varietà di effetti tossici negli animali e nell'uomo è stata osservata a causa dell'ingestione di cibo contaminato da micotossine, quali: immunosoppressione, effetti cancerogeni, genotossici, teratogeni o mutageni (Peraica et al., 1999; Richard, 2007). La contaminazione da micotossine è diventata una preoccupazione per la salute pubblica con gravi implicazioni economiche ed etiche. Dal momento che non è completamente possibile impedire la produzione di micotossine, le autorità nazionali e internazionali hanno adottato limiti regolatori e linee guida per monitorare i livelli di micotossine in vari prodotti alimentari e nei mangimi (EC 2006a e 2006b; Commision Recommendation 2013/165/UE). Diversi metodi fisici, chimici e biologici sono stati raccomandati per la detossificazione di alimenti e mangimi contaminati da micotossine. Tuttavia, solo alcuni di essi sono stati accettati per l'uso pratico. Molti specialisti pensano che l'approccio migliore per la decontaminazione da micotossine debba essere la degradazione biologica, dando la possibilità di rimuovere micotossine in blande condizioni, senza usare sostanze chimiche dannose e senza perdite significative nel valore nutritivo e nell’appetibilità di alimenti o mangimi detossificati. A seconda della loro modalità di azione, questi additivi per mangimi possono agire legando micotossine alla loro superficie (adsorbimento) o degradandoli o trasformandoli in metaboliti meno tossici (biotrasformazione). L'efficacia del legante di queste sostanze si basa sulle proprietà sia del legante che della micotossina. La biotrasformazione può essere ottenuta da enzimi che degradano le micotossine o da microrganismi (funghi e batteri) che producono tali enzimi. Vari adsorbenti inorganici, alluminosilicati e carboni attivi, sono stati testati e utilizzati come leganti micotossine (MB). Un'alternativa interessante agli adsorbenti inorganici per la detossificazione delle micotossine è l'uso di leganti organici, come i componenti della parete cellulare del lievito, i batteri dell'acido lattico, i conidi degli Aspergilli. Questi MB sono utilizzati l’alimentazione animale al fine di ridurre l'assorbimento delle micotossine dal tratto gastrointestinale e la loro distribuzione al sangue e agli organi bersaglio, prevenendo o riducendo le micotossicosi nel bestiame. Recentemente, l'uso di tali sostanze come additivi per mangimi tecnologici è stato ufficialmente autorizzato dall'Unione europea (Commission Regulation 2015/786). Enzimi ligninolitici, come le laccasi, dai funghi del marciume bianco, come Pleurotus spp. che catalizzano l'ossidazione di un ampio spettro di composti fenolici e di ammine aromatiche utilizzando l’ossigeno molecolare come accettore di elettroni, che viene quindi ridotto ad acqua (Reinhammar e Malstrom, 1981). Aggiungendo alla reazione l’appropriato mediatore redox può estendere l'attività degli enzimi laccasi a substrati non fenolici, come le micotossine. Questa tesi di dottorato è organizzata in sei capitoli e un allegato, in cui sono descritte le seguenti attività. Nel Capitolo 1 sono stati raccolti centosettantacinque campioni di grano durante le stagioni agricole: 2013-2014, 2014-2015 e 2015-2016 in diverse regioni italiane. I tricoteceni (DON, NIV, tossine T2 e HT-2) e i livelli di ZEA sono stati monitorati attraverso l'uso di metodi analitici validati, per fornire una visione d’insieme della distribuzione italiana delle micotossine nel grano. Le specie di Fusarium isolate dai semi sono state identificate in base alle loro caratteristiche morfologiche. Nel Capitolo 2, lo sviluppo di una tecnologia innovativa per la bioremedation del mais contaminato dall'AfB1 e della sua bioconversione in mangime ad un alto apporto nutrizionale, è stato realizzato attraverso lo sfruttamento della capacità degradativa del Pleurotus eryngii. A tale scopo, è stata studiata l'attività degradativa dei confronti dell’AfB1 da parte di un estratto enzimatico grezzo ottenuto da un substrato esausto e la capacità del fungo commestibile P. eryngii di degradare l'AfB1 sia in vitro che in una coltivazione dei funghi su scala di laboratorio. Nel Capitolo 3, è stata valutata la capacità del micelio non vitale del P. eryngii (ITEM 13681) di assorbire l’AfB1. Sono stati valutati l'influenza di diversi parametri, quali: pH (5, 7), concentrazioni dell’AfB1 (da 50 a 1000 ng/mL), tempo (da 30 a 120 min), temperatura (25, 37 ° C), massa fungina (da 50 a 1000 mg), sulla capacità di assorbimento del micelio di P. eryngii. La stabilità del legame AfB1-bioassorbente e gli studi di desorbimento sono stati effettuati variando, rispettivamente, il pH a 7 e 3, per 24 ore di incubazione a temperatura ambiente e al buio. Nel capitolo 4, l'attività di degradazione di due laccasi ottenute da due funghi commestibili (P. eryngii e P. pulmonarius) nei confronti di AfB1, AfM1, FB1, ZEA e tossina T2, sono state valutate singolarmente, aggiungendo alla reazione mediatori naturali ed artificiali. L'effetto dei sistemi laccasi-mediatore (LMSs) è stato analizzato mediante cromatografia liquida ad elevata prestazione accoppiata ad uno specifico rivelatore, scelto in base alle caratteristiche chimiche di ciascuna tossina. Nel capitolo 5, l'obiettivo perseguito era quello di investigare l'azione dei sistemi laccase-mediatore (LMSS) verso più tossine, simultaneamente. A tal fine, sono stati eseguiti diversi test di degradazione, esaminando l'effetto dei diversi mediatori, come acetosyringone (AS), syringaldehyde (SA) e del mediatore sintetico 2,2,6,6-tetrametil-piperidinil-ossil (TEMPO), sull'attività della laccasi da Trametes versicolor (CE 1.10.3.2) verso l'acido fusarico (FA) e micotossine, come: DON, T2, FB1, AfB1, OTA e ZEA. Un metodo multi micotossina, è stato sviluppato per determinare simultaneamente queste sette tossine, mediante cromatografia liquida con spettrometria di massa in tandem (LC-MS/MS). Nel capitolo 6, l'attività di degradazione dell’enzima laccasi verso lo ZEA è stata ulteriormente investigata. I prodotti della biodegradazione sono stati monitorati mediante cromatografia liquida con spettrometria di massa ad elevata risoluzione (LC-HRMS). I dati sono stati elaborati dal software MassHunter Workstation (Qualitative Analysis Navigator e Workflow di analisi qualitativa, versione B.08.00), Mass Profile Professional (versione 14.08) e MassHunter Molecular Structure Correlator (versione B.08.00)) di Agilent Technologies, per consentirne l'identificazione. Nell'Annesso A, la produzione di Enniatine (A, A1, B e B1) e Beauvericina da varie specie di Fusarium è stata valutata mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni accoppiata con array di fotodiodi e spettrometro di massa a singolo quadrupolo (UPLC-PDA-QDa).