Study of new molecular markers with non-invasive methods in respiratory diseases, with particular regard to Idiopathic Pulmonary Fibrosis

Background: Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) is a progressive fibrosing interstitial lung disease of unknown aetiology, which leads rapidly to death. As the diagnosis of IPF is complex, the search for non invasive biomarkers is of great relevance in consideration of the management of these patients. The aim of this study was to investigate in exhaled breath condensate (EBC) of IPF patients the mitochondrial DNA (MtDNA) alterations, as oxidative stress marker, and the potential role of Periostin and genetic microsatellite alterations (MAs) in IPF pathogenesis. Methods: 48 IPF patients were compared with 20 control subjects. Patients underwent EBC and blood collection. Content of mitochondrial DNA (MtDNA) and nuclear DNA (nDNA) was measured in EBC by Real Time PCR and the ratio between MtDNA/nDNA was calculated. Periostin was assessed by an enzyme-linked immunosorbent assay kit on EBC. Four microsatellite markers (THRA1, D17S579, D17S250 and D8S137) were used for the analysis of MAs. The EBC-DNA and WB-DNA were amplified by PCR; PCR products were analyzed using the ABI Prism 310 Genetic Analyzer. Results: Exhaled MtDNA/nDNA was higher in IPF patients compared to healthy controls (16.59 ± 10.30 vs 7.94 ± 4.56; p < 0.005). The level of MtDNA/nDNA was negatively correlated with FVC% (R = -0.4879, p = 0.006) and FEV1% (R = -0.4364, p = 0.018). Moreover, we were able to detect higher Periostin levels in the EBC of patients with IPF compared control subjects (65,5 ± 23,5 pg/mL vs 33 ± 21,4 pg/mL, p<0.05), respectively. MAs were found in 58.82 % of EBC-DNA and 12.50 % of WB-DNA in patients with IPF (p < 0.01). None of the healthy subjects exhibited MAs in the studied markers. Conclusions: There is an increase of MtDNA/nDNA ratio in IPF subjects that led us to suggest that there is a presence of mitochondrial dysfunction that confirms an important role of the oxidative stress in IPF. We also found that Periostin is measurable in the airways and increased in patients with IPF. Unlike serum Periostin, which may be derived from several sources outside the lung, airways Periostin could be a useful marker to better understanding the pathogenesis of IPF. Furthermore, we reported that the genetic alterations, studied in EBC, may play an important role in the complex genetic basis of IPF.

Introduzione: La fibrosi polmonare idiopatica (IPF) è una forma di polmonite interstiziale fibrosante ad eziologia sconosciuta, con andamento progressivo, che porta rapidamente alla morte. Poiché la diagnosi di IPF è complessa, la ricerca di nuovi biomarcatori, in particolare di quelli non invasivi è di grande importanza per la gestione di questi pazienti. Lo scopo di questo studio è stato quello di valutare, nell’esalato condensato (EBC) dei pazienti IPF, le alterazioni del DNA mitocondriale (MtDNA), marcatore di stress ossidativo, ed il potenziale ruolo della Periostina e delle alterazioni genetiche dei microsatelliti (MAs) nella patogenesi dell'IPF. Materiali e Metodi: 48 pazienti con diagnosi di IPF sono stati confrontati con 20 soggetti controllo. I pazienti sono stati sottoposti alla raccolta di EBC e di sangue. Il contenuto del DNA mitocondriale (MtDNA) e del DNA nucleare (nDNA) è stato amplificato e quantificato nell’EBC e nel sangue mediante Real Time PCR. Il rapporto tra MtDNA/nDNA è stato poi calcolato. La concentrazione della Periostina è stata valutata nell’EBC mediante test immunoenzimatico (ELISA). Quattro marcatori microsatellitari (THRA1, D17S579, D17S250 e D8S137) sono stati utilizzati per l'analisi delle MAs. Il DNA ottenuto dall'EBC e dal sangue è stato amplificato mediante PCR; i prodotti di PCR sono stati poi analizzati utilizzando un sequenziatore automatico (ABI Prism 310 Genetic Analyzer). Risultati: Il rapporto MtDNA/nDNA nell’EBC dei pazienti IPF è risultato essere più alto rispetto al gruppo di controllo (16.59 ± 10.30 vs 7.94 ± 4.56; p < 0.005). I livelli di MtDNA/nDNA hanno mostrato una correlazione negativa con il FVC% (R = -0.4879, p 0.006) e con il FEV1% (R = -0.4364, p = 0.018). Inoltre, i livelli di Periostina misurati erano più alti nell'EBC dei pazienti IPF rispetto al gruppo di controllo (65,5 ± 23,5 pg/mL vs 33 ± 21,4 pg/mL, p <0.05), rispettivamente. Alterazioni dei microsatelliti sono state evidenziate nel 58,82% dei campioni di EBC analizzati e nel 12,50% dei corrispettivi campioni di sangue dei pazienti IPF (p <0,01). Nessuno dei soggetti controllo ha mostrato MAs nei marcatori studiati. Conclusioni: Un aumento del rapporto MtDNA/nDNA nei pazienti IPF suggerisce la presenza di una disfunzione mitocondriale a conferma del ruolo dello stress ossidativo in questa patologia. Inoltre, abbiamo dimostrato la possibilità di dosare la Periostina nelle vie aeree e i livelli di quest’ultima sono risultati essere più alti nei pazienti IPF. A differenza della Periostina sierica, la Periostina delle vie aeree potrebbe rappresentare un utile marker per meglio comprendere la patogenesi dell'IPF. Infine, abbiamo riportato che le alterazioni genetiche, rilevate nell’EBC, potrebbero avere un ruolo importante nelle complesse basi genetiche dell'IPF.