Keap1/Nrf2 Pathway Profiling: Uncovers Molecular Intersection With Notch Pathway In Small Cell Lung Cancer

Small Cell Lung Cancer (SCLC) represents the most aggressive pulmonary malignancy and accounts for approximately 20% of lung cancers. Despite an initial chemotherapy and radiation response, it recurs rapidly after primary treatment by the development of resistance, with only 6% of patients surviving 5 years from diagnosis. In recent years, the efficacy of targeting key “growth drivers” in cancer treatment of a small subset of lung cancers are emerged encouraging the investigation of new molecular alterations and target proteins that are selectively expressed in cancer cells. Advances have been made especially for NSCLC, but similar results have not yet been possible in SCLC because of a lack of adequate tumor tissue and the rarity of surgically resected specimens. Cells are constantly exposed to oxidative stresses and exogenous and endogenous insults against they adopt several cytoprotective mechanisms. Central to this cellular defensive machinery is the NRF2 and its negative regulator, KEAP1. In tumor cells, mainly in non-small cell lung cancer (NSCLC) it has been observed that the KEAP1/NRF2 pathway is deregulated at genetic and epigenetic levels and it is linked to response conventional therapy and patients’ outcome. Moreover, growth and progression of lung tumors could involve additional pathways and their crosstalk in the context of cell invasion and metastasis, including NRF2/NOTCH crosstalk. This interplay should have strong implications in antioxidant protection, survival of cancer cells and drug resistance to therapies. At present, KEAP1/NRF2 pathway is poorly investigated in SCLC and data concerning the mechanisms of aberrant NRF2/NOTCH crosstalk by genetic and epigenetic modulations in SCLC are lacking. We propose to investigate the molecular basis of KEAP1/NRF2-NOTCH crosstalk deregulation in SCLC and its impact on the modulation of cellular defense systems, tumor cell proliferation, and differentiation and to the response to conventional chemotherapies and NOTCH inhibitors. Genetic and epigenetic investigations of the KEAP1, NRF2, and NOTCH1 genes were firstly performed on a collection of SCLC cell lines by Sanger sequencing, real-time PCR and pyrosequencing. Despite of the rarity of KEAP1 mutations in SCLC cell lines, an unreported hypermethylation of the KEAP1 promoter region was observed in SCLC cell lines with a prevalence of 42%, suggesting this mechanism as a possible new inactivation mechanism of this pathway in SCLC, with a perfect correlation between the results obtained both from real-time PCR and pyrosequencing methodologies. Gene silencing studies were carried out on SCLC cell lines by using short interfering RNA, protein expression analysis by western blot and pharmacological assays with chemotherapeutic agents. The results obtained showed as the first instance that KEAP1 silencing affects the NRF2 and some of its target genes expression levels thus giving the first functional evidence of the driver role in SCLC of KEAP1 in the NRF2 axis deregulation. Secondly, KEAP1 suppression showed a significant impact in predicting SCLC apoptosis under cisplatin, etoposide treatment and/or their combination. In light of these results, we verified whether and how the KEAP1/NRF2 pathway modulation interferes with NOTCH signaling under the KEAP1 gene silencing condition. Results obtained proved that KEAP1 impairing controls NOTCH1 and some of its target (HES-1 and DLL3) mainly at transcripts levels and has an only partial effect on protein levels. These data partially justified the observed effects of DAPT treatments in H69V KEAP1 silenced SCLC cell lines. NOTCH1, DLL3, and HES1 transcript levels increased in KEAP1 silencing H69V cell lines, whereas none of these proteins increased in their levels under DAPT treatment and no changes in viability assay of tumor cell were observed. Additional experiments of NRF2 silencing on several SCLC cell lines are demanded to clarify the real KEAP1-NRF2/NOTCH interplay. In summary, our data provide new insights into the potential downstream effects of KEAP1/NRF2 pathway deregulation in SCLC and its consequence in terms of crosstalk with NOTCH1 activity. The findings of this present study might help to guide the understanding of SCLC biology and the development of new potential therapeutic targets for prevention of this aggressive tumor.

Il tumore polmonare a piccole cellule (SCLC), detto anche microcitoma, costituisce circa il 20% dei tumori polmonari e rappresenta una delle istologie più aggressive nell’uomo in quanto è caratterizzato da una iniziale responsività alla chemio e alla radioterapia, a seguito della quale sviluppa velocemente resistenza ai trattamenti. Negli ultimi anni l’efficacia nel colpire i meccanismi molecolari che sono alla base dell’insorgenza e dello sviluppo dei tumori nell’uomo, ha spinto i ricercatori ad identificare e caratterizzare sempre nuove proteine che potessero fungere da bersaglio molecolare per la cura dei tumori polmonari. Gli scarsi dati in tal senso sui microcitomi polmonari sono dovuti alla sua elevata complessità molecolare ed alla scarsa disponibilità del materiale biologico da analizzare in una tipologia di tumore normalmente non destinato all’intervento chirurgico. La cascata cellulare regolata da KEAP1 ed NRF2 è un meccanismo conosciuto di difesa che le cellule adottano in condizioni di normalità per rispondere allo stress ossidativo e al possibile danno prodotto dalle sostanze tossiche e xenobiotiche con le quali entrano in contatto. Nelle cellule tumorali, questa cascata cellulare viene alterata ed è alla base della resistenza ai trattamenti chemio e radioterapici. La correlazione tra le alterazioni molecolari di questa cascata ed i tumori polmonari non a piccole cellule (Non Small Cell Lung Cancer, NSCLC) è ben nota e l’alterata espressione dell’NRF2 si correla alla prognosi dei pazienti e alla risposta alla chemio e alla radioterapia. D’altra parte, la crescita e la progressione dei tumori polmonari sembra coinvolgere ed intersecarsi con altre pathway ben note nel contesto dell’invasività cellulare e metastatizzazione, come quella di NOTCH, con importanti ricadute in ambito farmacologico. Attualmente, i dati riguardanti eventuali meccanismi di alterazione genetica ed epigenetica della cross-talk molecolare tra le pathway KEAP1/NRF2 e NOTCH risultano solo parziali e poco indagate nel microcitoma polmonare. Il lavoro di tesi si propone di ampliare le conoscenze dei meccanismi di intersezione tra KEAP1/NRF2 e NOTCH e delle basi genetiche ed epigenetiche della deregolazione della cross-talk nei microcitomi polmonari. Ulteriore finalità sarà quella di indagare mediante esperimenti in vitro gli effetti prodotti da queste ultime sulla risposta a terapie convenzionali e inibitori di NOTCH. Tutte le analisi sono state condotte su una collezione di linee cellulari di SCLC sulle quali è stato realizzato in primis il profilo molecolare dei geni KEAP1, NFE2L2 e NOTCH1 ed epigenetico della regione promotore del gene KEAP1. In particolare, per le determinazioni epigenetiche è stata implementata la già descritta metodica della PCR quantitativa metilazione-specifica in real-time (RT-QMSP, real time-quantitative methylation specific PCR) con saggi di pirosequenziamento. E’ stata identificata una sola mutazione missenso nel gene KEAP1 già descritta in letteratura, mentre il 42% delle linee cellulari analizzate hanno mostrato ipermetilazione a livello della regione promotrice del gene KEAP1, con una perfetta corrispondenza tra i risultati ottenuti in RT-QMSP e pirosequenziamento. Su alcune delle linee cellulari selezionate sono stati eseguiti studi di silenziamento genico del KEAP1 mediante short interfering RNA inhibition, analisi di espressione proteica mediante western blot e saggi farmacologici al fine di valutare la risposta farmacologica delle cellule in condizioni di silenziamento del KEAP1. I risultati ottenuti mostrano come 1) Il silenziamento del gene KEAP1 abbia effetto sulla cascata NRF2 mediata andando ad alterare sia l’espressione di NRF2 che quella di alcuni dei suoi geni target; 2) la soppressione dell’attività del KEAP1 mediante silenziamento genico produca una variazione significativa nella risposta delle cellule di microcitoma al trattamento chemioterapico (Etoposide, Cisplatino e loro combinazione) riducendo l’effetto di quest’ultimo sull’induzione dell’apoptosi e sull’inibizione della proliferazione cellulare. Sulla stessa linea KEAP1 silenziata si è verificato che l’inibizione dell’espressione di KEAP1 porta ad una parziale modulazione dei livelli di NOTCH e della sua attività e non sembra avere effetti sulla risposta al trattamento con il DAPT, inibitore delle γ-secretasi. I risultati ottenuti corroborano nel complesso l’ipotesi di una modulazione negativa da parte del KEAP1, di NRF2 e della sua attività nei SCLC, inoltre correlata con la resistenza delle cellule tumorali al trattamento chemioterapico con etoposide e cisplatino. Mostrano, inoltre, una prima evidenza di interazione tra NRF2/NOTCH nei SCLC ma non ancora chiaramente correlabile all’attività di KEAP1 che ad oggi non può essere considerato un marcatore predittivo di risposta di SCLC al trattamento con DAPT. Saranno necessarie ulteriori indagini allo scopo di trarre delle conclusioni definitive relativamente al ruolo dell’interazione KEAP1-indipendente/dipendente tra le pathway dell’NRF2 e del NOTCH nella modulazione del processo proliferativo ed apoptotico nel microcitoma polmonare. La robusta evidenza di un coinvolgimento della pathway KEAP1/NRF2 nei SCLC suggerisce come questa possa fornire invece già importanti indicazioni sulla resistenza all’uso di terapie convenzionali e rappresentare una indicazione terapeutica interessante per il trattamento del microcitoma polmonare.