Monocyte-derived miRNA and Extracellular Vesicles in patients with Multiple Sclerosis: evaluation as biomarkers MED/26

Multiple Sclerosis (MS) is a chronic autoimmune inflammatory demyelinating disease of the central nervous system (CNS). Recently, growing attention has been given to extracellular vesicles (EVs), microvesicles (MVs) and exosomes (EXOs), as important mediators of intercellular communication, in both physiological and pathological conditions such as MS. In immune cells, especially of the myeloid lineage, MV shedding is induced by the stimulation of the ATP receptor P2X7 through activation of acid sphingomyelinase (A-SMase) and mediates release of the inflammatory cytokine IL-1β. Accumulating evidence indicates that MVs may contain and transfer between cells small non-coding RNAs (miRNAs), which are deregulated in the immune and CNS of MS patients and are emerging as diseases biomarkers. In this study project we firstly evaluated how Fingolimod, a second line treatment for MS, may affect MVs production by the monocytes of the affected patients, as well as P2X7R, IL-1β expression and A-SMase activity. Thirty-seven MS patients were enrolled, nineteen of which started assuming Fingolimod. Purified monocytes from PBMCs were isolated from venous blood samples after 12 months of treatment. Eighteen healthy donors (HDs) were also recruited and similarly investigated. NBD C6- Sphingomyelin-labelled MVs were quantified by fluorimetry. A-SMase activity was determined using Amplex Red sphingomyelinase assay. P2X7R, IL-1β, A-SMase expression in monocytes were quantified by qRT-PCR. We found that basal production of MVs was higher in monocytes from untreated MS patients than Fingolimod treated patients or HDs. Upon BzATP stimulation, MVs production significantly increased in HDs and in patients treated with Fingolimod but not in untreated MS patients. Fingolimod was able to decrease such production compared to MS patients. Treatment, instead, increases P2X7R expression in Fingolimod treated patients compared to HDs in both conditions (KRH and BzATP stimulation). However, the drug reduced IL-1β expression and A-SMase activity in BzATP-stimulated monocytes from MS patients. This evidence reveals that treatment with Fingolimod reduces MVs production in MS patients by inhibiting A-SMase activity and suggests that monocyte MVs can be considered as a possible disease biomarker. As a second aim, we evaluated EV-miRNA cargo and the relative expression of the same miRNAs in parental cells of MS patients and HDs. For this purpose, 35 MS patients (21 RRMS and 14 PPMS) were enrolled and 16 HDs were similarly investigated. A set of specific miRNAs, important in the immune system and CNS as well as in the crosstalk between monocytes/macrophages and oligodendrocytes or neurons, was evaluated. In preliminary results we found detectable levels of a set of miRNAs, known to be altered in MS, in monocyte-derived EVs from both MS and HDs, i.e.miR-146a, miR-181a, miR-223, miR-23a, miR-30c, and miR125a. Differential expression analysis of these miRNAs in monocytes from HDs and MS patients was then evaluated. Taken together, our results suggest that the study of cellular miRNAs provides interesting information about their role in inflammatory response. Moreover their possible involvement in the synaptic function, in MS as well as in other neuroinflammatory disorders (OND), may certainly deserve consideration for future investigation. The challenge facing future research will be the optimization and standardization of methods to isolate and characterize EVs content in order to consider them as a possible diagnostic biomarker.

La sclerosi multipla (SM) è una patologia infiammatoria autoimmune cronica, demielinizzante e invalidante, del sistema nervoso centrale (SNC). Recentemente, un crescente interesse è stato rivolto alle vescicole extracellulari (EVs), in particolare microvescicole (MVs) ed esosomi (EXOs), risultati essere importanti mediatori della comunicazione tra cellule, in condizioni sia fisiologiche che patologiche. Diverse evidenze indicano che il rilascio delle MVs aumenta nelle cellule immunitarie, in particolare quelle della linea mieloide, dopo stimolazione con APT del recettore purinergico P2X7 (un recettore di segnale dell’ATP), attraverso l'attivazione della sfingomielinasi acida (A-SMase), che media anche il rilascio della citochina infiammatoria IL-1β. Il contenuto delle MVs comprende acidi nucleici, proteine cellulari e lipidi che possono essere trasferiti alle cellule target. In particolare, le MVs sono in grado di trasferire piccole sequenze di RNA non codificanti (miRNA), che sono deregolati nel sistema immunitario e nel SNC di pazienti affetti da SM e che stanno emergendo come nuovi biomarcatori di malattia. Il principale obiettivo di questo studio è indagare l’effetto del Fingolimod, un trattamento di seconda linea per la SM, sulla produzione delle MVs e dei pathways cellulari coinvolti in monociti di pazienti affetti, utilizzando un approccio sperimentale che sfrutta la quantificazione spettrofotometrica e la valutazione dell’espressione genica mediante Real-time PCR. Trentasette pazienti con SM sono stati arruolati, diciannove dei quali in trattamento con il Fingolimod e valutati dopo 12 mesi di trattamento. Diciotto donatori sani (HDs) sono stati inoltre reclutati e analizzati nello stesso modo. Le MVs, marcate con NBD C6-Spingomielina, sono state quantificate mediante metodo spettrofotometrico. L'attività di A-SMase è stata determinata utilizzando il dosaggio fluorimetrico del reagente Amplex Red, mentre l'espressione del recettore P2X7, IL-1β e A-SMase nei monociti è stata quantificata mediante qRT-PCR. Abbiamo riscontrato che la produzione basale di MVs è più alta nei monociti di pazienti con SM non trattati rispetto ai pazienti trattati con Fingolimod o HDs. La stimolazione con il Benzoil-ATP, un analogo sintetico dell’ATP, incrementa significativamente la produzione di MVs negli HDs e nei pazienti trattati con Fingolimod, ma non nei pazienti con SM. Abbiamo osservato che il trattamento è in grado di ridurre la produzione delle MVs nei monociti rispetto ai pazienti SM non trattati, sia in condizioni di stimolo che di non stimolo. L'espressione del recettore P2X7 aumenta, invece, nei pazienti trattati con Fingolimod rispetto ai HDs in entrambe le condizioni. Tuttavia, il farmaco riduce l'espressione di IL-1β e l'attività di A-SMase nei monociti stimolati con BzATP in pazienti con SM. Complessivamente, i nostri risultati suggeriscono che le MVs aumentano in corso di malattia e che il trattamento con Fingolimod è in grado di ridurre la produzione delle stesse inibendo l'attività di A-SMase. I nostri dati suggeriscono, inoltre, che le MVs monocitarie possono essere considerate come un possibile biomarker di malattia. In secondo luogo, abbiamo valutato l’espressione di alcuni microRNA nelle EVs e la relativa espressione degli stessi miRNA nei monociti di pazienti affetti da SM e HDs. A tale scopo, sono stati arruolati 35 pazienti affetti da SM (21 RRMS e 14 PPMS) e 16 HDs, analizzati in maniera analoga. Sono stati valutati dei miRNA specifici, noti per essere importanti nella regolazione del sistema immunitario e del SNC, così come nel crosstalk tra monociti/macrofagi e oligodendrociti o neuroni. Risultati preliminari rivelano livelli detectabili di un set di miRNAs, per esempio il miR- 146a, miR-181a, miR-223, miR-23a, miR- 30c e il miR125a noti per essere alterati nella SM, in EVs isolate da monociti di pazienti e HDs. Successivamente abbiamo valutato l’espressione differenziale di questi miRNAs in monociti da pazienti e HDs. Complessivamente, i nostri dati suggeriscono che lo studio dei miRNAs cellulari può fornire informazioni sul loro ruolo nella risposta infiammatoria. Inoltre, il loro possibile coinvolgimento nelle funzioni sinaptiche, nella SM e in altre malattie neuroinfiammatorie, è sicuramente meritevole di ulteriori considerazioni per studi futuri. L’ottimizzazione e la standardizzazione dei protocolli per isolare e caratterizzare il contenuto di EVs rappresenta la sfida che la ricerca futura dovrà affrontare al fine di identificare nuovi biomarcatori.