Evaluation of the putative healthy effects of food phytochemicals: effect on blood antioxidant status, human cells and enzyme activities

During the last few decades, dietary antioxidants have received increasing attention, especially within biological, medical and nutritional fields, owing to their putative protective roles against the deleterious oxidative-induced reactions implicated in the pathogenesis of several human diseases. A considerable number of analytical assays has been developed claiming to ensure a fast, simple, convenient, and reliable in vitro determination of total antioxidant capacity (AC) of pure compounds or complex matrices, such as foods and biological samples. Nevertheless, methods for in vitro AC measurement show many technical and conceptual limitations. Moreover, in vitro AC measurements of foods alone have not been demonstrated to be relevant for the biological effects of specific bioactive compounds since they do not provide information about bioavailability of food antioxidants, as well as their in vivo stability, retention by tissues and in situ reactivity. Therefore, the target of this research was of developing innovative methodologies/approaches able to provide information as much as possible reflecting the in vivo response. The model of study adopted to carry out the research consists of three sequential levels of study. The first level regards AC measurement of plant foodstuffs. At this level, a first methodological advancement of “QUENCHERABTS” (QUick, Easy, New, CHEap and Reproducible) method has been attempted. It is based on the direct reaction of ABTS•+ reagent with fine solid food particles without extraction of antioxidants. In particular, by adopting a new slope calculation procedure, the applicability of QUENCHERABTS method was extended to the study of larger particles (up to 0.5 mm). This may be of interest in the case of some cereal milling products. In addition to the QUENCHERABTS calculation upgrade, research relative to the first level of investigation has regarded the development of the novel Lipoxygenase (LOX)-Fluorescein (FL) method. The new LOX-FL method is based on the LOX-1 isoenzyme reaction to generate physiological reactive species and provides an AC assessment more reliable from a physiological point of view with respect to other widely used assays. This method was applied on both extracts from the antioxidant-rich dietary cereal supplement Lisosan G and serum (seven subjects) during 240 min after intake of 20 g of supplement. Interestingly, LOX-FL method discriminated in vitro AC of four different Lisosan G extracts similarly to ORAC and TEAC methods, used for comparison. Contrarily, only LOX-FL method was able to highlight a general increase of serum AC (up to 40% after 30 min) after Lisosan G intake, thus confirming its physiological effectiveness by ex vivo serum assay. For the property to be applied to both in vitro and ex vivo AC measurements, LOX-FL assay was used also in the second level of investigation, concerning the evaluation of human blood antioxidant status after food intake. Unfortunately, contrasting results have been obtained from blood AC assessment after consumption of antioxidant-enriched foods, suggesting the unsuitability of blood AC measurements alone and the need to consider also changes of serum oxidative status. In the light of this, we propose the use of a novel parameter, the “Antioxidant/Oxidant Balance (AOB)”, representing the ratio between serum AC and serum oxidant status, evaluated as “Peroxide Level” (PxL). AOB approach was applied for the first time to evaluate effects on serum antioxidant status during the first four hours after intake of two antioxidant-supplemented pastas, the Bran Oleoresin (BO) and Bran Water (BW) pastas, enriched respectively with either lipophilic or hydrophilic/phenolic antioxidants extracted from durum wheat bran. Interestingly, similarly to the highly active Lisosan G, intake of BO pasta allowed a significant improvement of serum AOB, until 70% as evaluated as LOX-FL/PxL. Contrarily, BW pasta induced a serum oxidative effect so as a Reference pasta and glucose, used for comparison. Overall, these findings indicate that AOB approach appears an excellent tool in highlighting effects of antioxidant-enriched food consumption, which cannot be predicted by ex vivo analysis of AC alone, as well as by in vitro measurements of cooked foods. The third level of investigation concerns the evaluation of effects exerted by bioactive compounds at the cellular and sub-cellular levels. In particular, biological effects of some phytochemicals were evaluated on activity of: i) Glyoxalase I (Glo I), implicated in enzymatic cell defence against dicarbonyl stress ii) sirtuins, a family of NAD+- dependent deacetylases involved in the regulation of cellular transcription, apoptosis, cell division and metabolism. Concerning Glo I, two studies were carried out. In the first study, the effect of sulforaphane (SR), an isothiocyanate abundant in Brassica vegetables, on the expression and activity of GloI and on the levels of reduced glutathione (GSH) in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) was investigated. Incubation for 24 h and 48 h of PMBCs with 2.5 μM SR (simulating a daily consumption of a broccoli portion) did not induce a substantial increase in GloI activity and expression while caused a reduction until 73% in GSH levels compared to the control cells. This suggests the formation of a GSH-SR adduct able to significantly reduce the actual SR concentration within the cells during incubation, so explaining the lack of a substantial effect on GloI expression observed in this study. In the second study, the effect of some phytochemicals was evaluated on GloI activity in highly purified mitochondrial fraction obtained from durum wheat seedlings (WM). Mitochondrial GloI was chosen since mitochondria represent one of the major targets of MG-mediated carbonylation/oxidative stress. Interestingly, a hight GloI activity was measured in WM, showing a hyperbolic dependence on substrate concentration, with Km and Vmax values equal to 0.27 mM and 0.133 EU/mg of protein, respectively. Concerning the study of modulation by phytochemicals, curcumin and quercetin were found to strongly inhibit WM-GloI activity in a competitive manner. In the last study, a novel experimental approach for reliably measuring sirtuin activity in cell extracts and/or subcellular organelles was proposed. It involves the combined use of very different enzymatic assays, the bioluminescent SIRT-Glo™ and HTRF® technology-based SIRT1 assays, and a comparative determination of activity of a recombinant human sirtuin 1 isoform (hSIRT1). By using the newly proposed approach, a high and nicotinamide-sensitive specific sirtuin activity was determined in WM, equal 268±10 mU∙mg-1 protein, as maeasured by HTRF® assay, and 166±12 ng hSIRT1 eq.∙mg-1 protein, as evaluated by the bioluminescent assay. Concerning sirtuin modulation, no significant effect of resveratrol and quercetin was found on WM-sirtuin and hSIRT1 activities by using HTRF® assay. Taken together, results reported in this PhD thesis strongly demonstrate the crucial importance of the methodological approach in assessment of putative healthful properties of dietary phytochemicals; it is necessary to avoid incorrect and misleading data interpretation about antioxidant properties of foods.

Negli ultimi decenni, gli antiossidanti alimentari hanno ricevuto crescente attenzione, soprattutto in ambito biologico, medico e nutrizionale, in relazione alla loro capacità di contrastare lo stress ossidativo implicato nella patogenesi di diverse patologie cronico-degenerative. Numerosi sono i metodi attualmente disponibili in letteratura per valutare la capacità antiossidante (CA) in vitro degli alimenti. In tutti i casi si tratta di metodi semplici, rapidi e poco costosi che consentono di misurare la CA sia su composti puri che su matrici complesse, come alimenti e campioni biologici. Tuttavia, i metodi per valutazione della CA in vitro, spesso evidenziano numerose limitazioni sia tecniche che concettuali. La principale limitazione tecnica è legata alla natura chimica sulla quale si fondano che rende difficile il confronto fra i valori di CA ottenuti con le diverse metodiche analitiche. La principale limitazione concettuale, invece, è legata alla difficoltà di poter attribuire alle misure di CA un reale significato fisiologico. Le misure di CA degli alimenti, infatti, non consentono di valutare quella che è la reale biodisponibilità dei composti antiossidanti assunti con la dieta. Esse, infatti non tengono conto né della stabilità in vivo, né della ritenzione nei tessuti né della reattività in situ dei composti antiossidanti. Pertanto, il target di questa ricerca è stato quello di mettere a punto un nuovo approccio che, mediante l’utilizzo di metodologie innovative, consenta di ottenere informazioni sul potenziale valore salutistico degli alimenti che siano realmente indicative della risposta che essi procurano in vivo. Lo studio si è articolato su tre livelli sequenziali di indagine. Il primo livello ha riguardato l’analisi in vitro dell’alimento effettuata mediante misure di CA sui diversi estratti ottenuti dall’alimento. A questo livello, è stato in primo luogo condotto un avanzamento del metodo "QUENCHERABTS" (QUICK, Easy, New, CHEap and Reproducible); il metodo si basa sulla reazione diretta del radicale cationico ABTS·+ con particelle fini di alimenti solidi senza che venga effettuata una preliminare estrazione degli antiossidanti. Mediante una nuova procedura di calcolo, l'applicabilità del metodo QUENCHERABTS è stata estesa allo studio di particelle più grandi (fino a 0,5 mm). Questo può essere interessante nel caso di alcuni prodotti dell’industria molitoria. Oltre all’avanzamento del metodo QUENCHERABTS, la ricerca relativa al primo livello di indagine ha riguardato lo sviluppo del nuovo metodo Lipoxygenase (LOX) -Fluorescein (FL). Il nuovo metodo LOX-FL si basa su un approccio più vicino alle condizioni fisiologiche rispetto ad altri metodi ampiamente utilizzati in letteratura. Esso utilizza l’isoforma 1 della lipossigenasi di soia per produrre specie radicaliche fisiologiche e la fluoresceina come probe per rilevare queste specie in fluorescenza. Il metodo LOX-FL è stato applicato sia alla misura della CA degli estratti ottenuti dall’integratore alimentare ricco in composti bioattivi Lisosan G sia alla misura della CA del siero (di sette soggetti) durante i 240 minuti successivi all’assunzione di 20 g dell’integratore. Per quanto riguarda l’analisi in vitro, il metodo LOX-FL è stato in grado di discriminare in termini di CA tra i quattro diversi estratti del Lisosan G, in modo simile ai metodi ORAC e TEAC, utilizzati come confronto. Al contrario, solo il metodo LOX-FL è stato in grado di evidenziare un aumento generale della CA del siero fino al 40% 30 minuti dopo l'assunzione di Lisosan G. Per la duplice proprietà di poter essere applicato sia a misure in vitro che ex vivo di CA, il metodo LOX-FL è stato utilizzato anche nel secondo livello di indagine, quello relativo alla valutazione dello stato antiossidante del sangue umano dopo l'assunzione dell’alimento. Data la semplicità nelle misure di CA e il facile accesso ai campioni di sangue umano, le misure di CA sul siero si sono diffuse tantissimo negli ultimi anni e hanno generato un elevatissimo numero di pubblicazioni. Purtroppo, i risultati sono abbastanza contrastanti; in alcuni casi, infatti, si è osservato solo un lieve aumento o addirittura un decremento della CA. Ciò suggerisce l'inadeguatezza delle misurazioni della sola CA del sangue e la necessità di considerare anche i cambiamenti dello stato ossidato del siero. Alla luce di ciò, è stato proposto l'uso di un nuovo parametro, definito “Antioxidant/Oxidant Balance” (AOB), che rappresenta il rapporto tra la CA e lo stato ossidato del siero, valutato come "Peroxide Level" (PxL). L'approccio basato sull’uso dell’AOB è stato applicato per valutare gli effetti sullo stato antiossidante del siero nelle prime quattro ore successive all'assunzione di due putative paste funzionali, la pasta Bran Oleoresin (BO) e la pasta Bran Water (BW), arricchite rispettivamente con antiossidanti lipofili e idrofili/ fenolici estratti dalla crusca di frumento duro. Analogamente al Lisosan G altamente bioattivo, l'assunzione di pasta BO ha procurato un significativo incremento dell’AOB del siero, fino al 70% quando calcolato come LOX-FL/PxL. Al contrario, la pasta BW ha un effetto ossidante sul siero, analogamente alla pasta controllo (Reference pasta) e al glucosio, usati come confronto. Complessivamente, questi risultati indicano che il parametro AOB appare uno strumento eccellente per evidenziare l’effetto del consumo di alimenti ricchi di antiossidanti sul sangue; tale effetto, inoltre, non può essere assolutamente previsto dalle misure in vitro della matrice, ne dall'analisi ex vivo della sola CA del siero. Il terzo livello di indagine è quello relativo alla valutazione degli effetti esercitati dai composti bioattivi a livello cellulare e subcellulare. In particolare, gli effetti biologici di alcuni phytochemicals alimentari sono stati valutati sull'attività degli enzimi: i) Gliossalasi I (GloI), implicato nella difesa cellulare contro gli effetti dannosi dello stress da carbonilazione ii) Sirtuine, una famiglia di deacetilasi NAD+-dipendenti coinvolte nella regolazione di importanti processi cellulari quali trascrizione genica, apoptosi, metabolismo e divisione cellulare. Per quanto riguarda l’enzima Glo I, sono stati effettuati due studi. Nel primo studio è stato valutato l’effetto del sulforafano (SR), un isotiocianato abbondante nei broccoli, sull'espressione e l'attività di GloI e sui livelli di glutatione ridotto (GSH) in cellule mononucleate di sangue periferico (Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMCs). L'incubazione per 24/48 ore dei PMBCs con 2,5 μM SR (che simula la quantità assunta con una porzione di broccoli) non ha indotto un aumento sostanziale dell'attività e dell'espressione di GloI, mentre ha causato una riduzione fino al 73% dei livelli di GSH rispetto alle cellule di controllo. Ciò suggerisce la formazione di un addotto GSH-SR che, riducendo significativamente la reale concentrazione di SR all'interno delle cellule durante l'incubazione, spiegherebbe la mancanza di un sostanziale effetto sull'espressione di GloI osservata in questo studio. Nel secondo studio è stato valutato l'effetto di alcuni phytochemicals sull'attività di GloI nella frazione mitocondriale altamente purificata isolata da plantule di frumento duro (Wheat Mitochondria, WM). È stata studiata la GloI mitocondriale poiché i mitocondri rappresentano uno dei principali bersagli della carbonilazione oltre che dello stress ossidativo. In questi organelli è stata dapprima misurata un'elevata attività di GloI; lo studio della cinetica di reazione ha consentito di osservare una dipendenza iperbolica dall’attività enzimatica dalla concentrazione di substrato e di misurare Km e Vmax che sono pari a 0,27 mM e 0,133 UE / mg di proteine, rispettivamente. Per quanto riguarda lo studio della modulazione, tra i phytochemicals testati soltanto curcumina e quercetina sono risultate in grado di inibire l'attività di GloI in WM. Uno studio dettagliato dell’inibizione ha consentito, inoltre, di verificare la natura competitiva dell’inibizione e di calcolare valori di Ki pari a 20 μM e 55 μM per la curcumina e la quercetina, rispettivamente. Infine, è stato condotto uno studio finalizzato a sviluppare un nuovo approccio sperimentale che consenta di misurare in modo affidabile l'attività sirtuina in estratti cellulari e/o in organelli subcellulari. Questo approccio consiste nell’uso combinato di due diversi sistemi di dosaggio basati su un razionale molto diverso, il dosaggio SIRT-Glo™ che lavora in luminescenza e un metodo basato sulla tecnologia HTRF, e confronto con l’enzima ricombinante umano SIRT1 (human SIRT1, hSIRT1). Usando l'approccio appena descritto, è stata determinata un'attività specifica di sirtuine in WM molto alta, pari a 268 ± 10 mU ∙ mg-1 di proteine, con saggio HTRF®, e di 166 ± 12 ng di hSIRT1 eq. ∙ mg- 1 di proteine, con il metodo bioluminescente. Per quanto riguarda la modulazione dell’attività di sirtuina, utilizzando il saggio HTRF®, non è stato osservato nessun significativo effetto da parte di resveratrolo e quercetina sull’attività di sirtuina in WM. Globalmente, i risultati riportati in questa tesi dimostrano l'importanza cruciale dell'approccio metodologico nella valutazione delle potenziali proprietà salutistiche dei phytochemicals alimentari; ciò, infatti, è assolutamente necessario se si vuole evitare un’interpretazione errata e fuorviante dei dati relativi alle proprietà antiossidanti degli alimenti.