Green degradation of mycotoxins by biotechnological application of enzymes from Pleurotus spp

Mycotoxins are toxic secondary metabolites produced by filamentous fungi mainly belonging to Aspergillus, Penicillium, Fusarium and Alternaria genera. They can be found as common contaminants of cereals, fruits, seeds and spices as a result of fungal spoilage. Mycotoxin contamination is an significant health and economic concern worldwide. Some of them were recognized by the International Agency of Research on Cancer (IARC) as carcinogenic (aflatoxin of the B and G series), possible carcinogenic (aflatoxin M1, AFM1; fumonisin B1, FB1; ochratoxin A, OTA) to humans. Moreover, they exert both acute and chronic toxic effects towards humans and animals. Because of mycotoxin contamination, billions of dollars are lost every year due to unsold commodities, decrease of animal health and productivity or to sustain a complex and integrated mycotoxin management system. Prevention strategies are not completely effective and require the implementation of novel post-harvest methods, able to mitigate or remove mycotoxins from contaminated materials. The aim of this thesis was to evaluate and study the capability of laccase enzymes to reduce mycotoxin contamination both in vitro and in contaminated materials through an environmental friendly and mild approach. In addition up to eight different redox mediators were used within the laccase mediator system (LMS) to maximize mycotoxin degradation. Within this purpose, the activity of two different purified LCs, native Lac2 from Pleurotus pulmonarius and the recombinant Ery4 from P. eryngii, was tested towards the main classes of mycotoxins. Lac2 was identified and evaluated for the in vitro degradation of aflatoxins, while Ery4 was tested towards AFB1, AFM1, FB1, OTA, deoxynivalenol (DON), zearalenone (ZEN) and T-2 toxin. The preliminary screening revealed that the inclusion of a toxin - specific redox mediator is required to achieve high levels of degradation with both enzymes. However, the use of the LMS resulted ineffective for DON and not efficient for OTA. ii

Le micotossine sono metaboliti secondari tossici, prodotti da funghi filamentosi che appartengono principalmente ai generi Aspergillus, Penicillium, Fusarium e Alternaria. Sono comuni contaminanti alimentari di cereali, frutta, semi e spezie, prodotti a seguito di contaminazione fungina. La contaminazione da micotossine ha un impatto importante sulla salute mondiale e sulla sua economia. Alcune di esse sono classificate come sostanze cangerogene umane (aflatossine delle serie B e G) o possibili cancerogene umane (aflatossina M1, AFM1, fumonisina B1, FB1 e ocratossina A, OTA) dall’Agenzia Internazionale per la Ricerca sul Cancro (IARC). Inoltre, esplicano una azione tossica, sia acuta che cronica, su umani e animali. A causa della contaminazione da micotossine, milioni di dollari vengono persi ogni anno a causa di commodities invendute, problemi di salute e diminuzione della produttività degli animali e per la messa a punto di sistemi complessi e integrati di lotta e gestione di queste problematiche. Le strategie preventive non sono completamente efficaci e richiedono di essere implementate con nuove strategie di riduzione che agiscano nel post raccolta e che siano in grado di ridurre o di rimuovere le micotossine dai materiali contaminati. Lo scopo di questa tesi è stato quello di valutare e studiare la capacità delle laccasi di ridurre la contaminazione di micotossine, sia in vitro che in materiali contaminati, attraverso un approccio non invasivo sugli alimenti e sull’ambiente. Inoltre, fino a otto diversi mediatori redox sono stati utilizzati insieme alle laccasi nel cosiddetto Sistema Laccasi Mediatore (LMS) per massimizzare la degradazione delle micotossine. Per raggiungere questo scopo, l’attività di due diverse laccasi purificate, la Lac2 da Pleurotus pulmonarius e la ricombinante Ery4 da P. eryngii sono state testate contro le maggiori classi di micotossine. La Lac2 è stata identificata e valutata per la degradazione in vitro delle aflatossine, mentre la Ery4 è stata testata contro AFB1, AFM1, FB1, OTA, deossinivalenolo (DON), zearalenone (ZEN) e tossina T-2. iv Lo screening preliminare ha rivelato che l’inclusione di un mediatore redox nel mix di reazione è necessario per raggiungere un alto livello di degradazione con entrambi gli enzimi. Tuttavia, l’ LMS è risultato non completamente efficace per la degradazione dell’OTA e non efficace per la degradazione del DON. Attraverso l’uso di uno specifico LMS è stata ottenuta anche la degradazione simultanea di due diverse coppie di tossine, AFB1/ZEN e FB1/ tossina T-2. In aggiunta, il trattamento con LMS è stato utilizzato con successo in matrici artificialmente e naturalmente contaminate, latte e farina di mais, per la degradazione di AFM1 e ZEN, rispettivamente. Nonostante le grandi potenzialità mostrate da entrambi gli enzimi nel campo del biorisanamento, le laccasi restano dei biocatalizzatori versatili che possono essere utilizzati in una grande varietà di processi. L’applicazione dell’LMS è stato studiato in dettaglio nel latte per valutarne l’effetto sulle proteine del latte e la possibilità di produrre una cagliata con proprietà tecnologiche e nutrizionali migliorate. I risultati presentati in questa tesi pongono le basi per lo sviluppo di un metodo di biotrasformazione basato su un approccio enzimatico che apre nuove prospettive per l’utilizzo di un biocatalizzatore versatile e green, come la laccasi, nel campo della sicurezza e della qualità delle derrate alimentari contaminate da micotossine.