Study of molecular basis of Oculo-Auricolo-Vertebral-Spectrum

Oculo auriculo vertebral spectrum (OAVS; OMIM 164210) is a clinically and genetically heterogeneous disorder originating from an abnormal development of the first and second branchial arches. Main clinical characteristics include defects of the aural, oral, mandibular, and vertebral development. Anomalies of the cardiac, pulmonary, renal, skeletal, and central nervous systems have also been described. The aetiology of OAVS remains largely obscure. Nevertheless, the identification of several families with proof of both autosomal dominant and autosomal recessive inheritance, as well as detection of several chromosomal aberrations, strongly suggest that OAVS has a genetic basis. The advent of next-generation sequencing (NGS) surmounts these issues and changes the landscape of rare-genetic-disease research, with the possibility of identifying genetic disease causative genes at an accelerating time-rate. The aim of this work is to study the OAVS molecular bases identifying genes included in microriarrangements using SNP array technology and new candidate genes throughout targeted or exome sequencing. In a large court of 84 clinically well-characterized OAVS patients, some microduplications and microdeletions have been identified, involving genes belonging to the EYA-SIX- and PAX pathways, previously associated with OAVS. Starting from the genes involved in these microriarrangements, a panel of 78 genes has been drawn, including genes implicated in the molecular pattern of the first and second branchial arch development and genes associated with pathologies with a clinical phenotype overlapping with OAVS. In detail, NGS analysis has identified two missense variants in GCS and PLCB4 genes in two sporadic patients belonging to two unrelated families. Animal models have shown that both of these genes are involved in the early stages of embryonic development and, specifically, in the formation of branchial arches, confirming their role in the etiology of OAVS. Two missense variants and a maternally inherited in-frame deletion were also identified in the MYT1 gene recently associated with OAVS. MYT1 gene is involved in the retinoic acid pathway as one of the teratogenic agents associated with OAVS. The identification of these three variants confirms the involvement of MYT1 gene in the etiopathogenesis of this pathology. A second nonsense mutation in the HOXA2 gene was also identified in a family only presenting isolated microtia. Retrospective studies on the only other patient reported in literature, showed that both patients displayed a particular shape of the outer helix of the ear, compared to other isolated microtia forms. Finally, the analysis of the whole exome was performed in four affected subjects, belonging to a family of three generations, in which the clinical features segregated as autosomical dominant way with incomplete penetrance and variable expression. Two splicing variants and a missense variant were identified in the RNF213, SHPRH and ITGB4 genes, respectively, in all affected and non-affected members of the family. Unfortunately, none of these genes seems to suggest a possible correlation with the aetiological hypotheses brought up until now. This work, therefore, contributed to the expansion of the microdeletion and microduplication spectrum associated with OAVS, presented the first time a point mutation in the GCS gene previously associated with OAVS throughout linkage studies, and the identification of a mechanism of allelic heterogeneity linked to the presence of a mutation in PLCB4 gene, previously associated with Auricolar Condylar Syndrome, in a patient with a Goldenhar phenotype. Finally, it has been contributed to the identification of the second nonsense mutation in the HOXA2 gene in a patient with isolated microtia and a distinctive ear morphology. All these findings provide further evidence of the molecular mechanisms underlying OAVS, confirming the genetic heterogeneity of this pathology and helping to identify new genotype-phenotypic correlations. Identification of new candidate genes better provide the basis for appropriate genetic testing, clinical management, genetic counseling, with improvements in risk assessment, prognosis and prevention, and for the development of new therapeutic approaches.

Lo spettro Oculo auriculo vertebrale (OAVS; OMIM 164210) è una patologia clinicamente e geneticamente eterogenea che deriva dallo sviluppo anomalo dei derivati del primo e del secondo arco branchiale. Le principali caratteristiche cliniche includono difetti dello sviluppo oculare, auricolare, mandibolare e vertebrale. Possono inoltre essere presenti anomalie del sistema nervoso centrale, anomalie cardiache, polmonari, renali e scheletriche. Sebbene l’eziologia non sia ancora nota, l'individuazione di alcune famiglie che presentano un eredità di tipo autosomico dominante e autosomico recessivo, e l'identificazione di alcune anomalie cromosomiche, suggeriscono che l’ OAVS possa avere una base genetica e un’eziologia eterogenea. Recentemente l’avvento di nuove tecnologie di sequenziamento (NGS), consentendo l’analisi di molti geni contemporaneamente, hanno permesso di identificare nuovi geni candidati in alcune patologie geneticamente eterogenee. L'obiettivo di questo lavoro è lo studio delle basi molecolari dell’OAVS attraverso l’individuazione di geni coinvolti in microriarrangiamenti mediante la metodica SNP array e l’individuazione di nuovi geni candidati mediante il sequenziamento targettato o il sequenziamento dell’intero esoma. A tal proposito abbiamo identificato in un’ampia corte di 84 pazienti OAVS clinicamente ben caratterizzati, alcune microduplicazioni e microdelezioni che coinvolgevano geni appartenenti al pathway di EYA-SIX- e PAX , già precedentemente associato all’ OAVS. Partendo poi dai geni coinvolti in questi microriarrangiamenti è stato disegnato un pannello di 78 geni fra i quali anche i geni implicati nel pattern molecolare dello sviluppo del primo e del secondo arco branchiale e geni associati a patologie con fenotipo clinico sovrapponibile all’OAVS. In particolare l’analisi NGS ha permesso di identificare due varianti missenso nei geni GCS e PLCB4 in due pazienti sporadici appartenenti a due famiglie non imparentate fra loro. Modelli animali hanno dimostrato che entrambi questi geni sono coinvolti nelle prime fasi dello sviluppo embrionale e, in maniera specifica, nella formazione degli archi branchiali, confermando un loro ruolo nell’eziologia dell’OAVS. Sono state inoltre identificate due varianti missenso ed una delezione “in-frame” nel gene MYT1 recentemente associato all’OAVS, una delle quali ereditata da un genitore apparentemente sano. Il gene MYT1 è coinvolto nel pathway dell’acido retinoico, uno degli agenti teratogeni associati all’OAVS. L’identificazione di queste tre varianti conferma il coinvolgimento del gene MYT1 nell’eziopatogenesi di questa patologia. E’ stata inoltre identificata una seconda mutazione nonsenso nel gene HOXA2 in una famiglia che presentava esclusivamente microtia isolata. Studi retrospettivi condotti sull’unico altro paziente presente in letteratura, hanno dimostrato come entrambi i pazienti presentavano, rispetto ad altre forme di microtia isolata, una particolare forma dell’elice esterno dell’orecchio. Infine è stata eseguita l’analisi dell’intero esoma in quattro soggetti affetti, appartenenti ad una famiglia costituita da tre generazioni, in cui le caratteristiche cliniche segregavano in maniera autosomica dominante a penetranza incompleta ed espressività variabile. Sono state identificate due varianti di splicing e una variante missenso rispettivamente nei geni RNF213, SHPRH e ITGB4 in tutti i membri affetti e non affetti appartenenti alla famiglia. Sfortunatamente nessuno di questi geni sembra suggerire una possibile correlazione con le ipotesi eziologiche fino ad oggi postulate. Questo lavoro pertanto ha contribuito all’ampliamento dello spettro delle microdelezioni e microduplicazioni associate all’OAVS, ha contribuito per la prima volta all’identificazione di una mutazione nel gene GCS precedentemente associato all’OAVS mediante studi di linkage, e all’identificazione di un meccanismo di eterogeneità allelica legata alla presenza di una mutazione nel gene PLCB4, in precedenza associato alla sindrome auricolo condilare, in un paziente con un fenotipo Goldenhar. Ha infine contribuito ad identificare la seconda mutazione nel gene HOXA2 in un paziente con microtia isolata e una particolare configurazione auricolare. Tutti questi risultati forniscono ulteriori evidenze sui meccanismi molecolari alla base dell’OAVS, confermando anche l’eterogeneità genetica di questa patologia e contribuendo ad identificare nuove correlazioni genotipo-fenotipo. L’identificazione di nuovi geni candidati sarà inoltre importante per lo sviluppo di nuovi test genetici e nuove prospettive terapeutiche nei pazienti con OAVS.