Molecular analysis and genotype-phenotype correlation in patients affected by hyperphenylalaninemias in southern italy

The hyperphenylalaninemia (HPA), an autosomal recessive genetic disorder, is the result of a defect of enzyme phenylalanine hydroxylase (PAH), resulting in the accumulation of phenylalanine (Phe) in the blood. In most cases (about 98%), the phenotypic expression of disease is the result of the presence of mutations in the PAH gene, coding for the enzyme PAH, with 12q24.1 locus on chromosome 12. The disease has a frequency in the Caucasian population of about 1 in 10,000 live births, corresponding to a carrier frequency of about 1 to 50; the majority of affected individuals are identified in the neonatal period by screening programs (mandatory in several countries, such as Italy) on the general population. HPA is expressed with a significant variability of phenotypic expression and with different degrees of severity. Food therapy, based on a limited intake of phenylalanine, prevents neurological damage. Phenotypes of hyperphenylalaninemia are defined based on the levels of phenylalanine in the blood at birth: classical phenylketonuria (PKU), with values of Phe in the plasma >1200 μmol/L (>20 mg/dl); mild form of PKU with phenylalaninemia levels comprised between 600 and 1200 μmol/L (10-20 mg/dl); Non-PKU hyperphenylalaninemia (HPA-non PKU or MHP) when the values of phenylalaninemia are below 600 μmol/L (<10 mg/dl). To date, through the molecular analysis of PAH gene, about 600 mutations have been identified (the majority are missense) and over 50% of patients are composite heterozygous. The considerable number of identified mutations is a substantial evidence of allelic heterogeneity of the underlying pathology that justifies the variable expressivity (even within the same family). The project aims first to increase the knowledge about the molecular and biochemical mechanisms of the disease, still not fully known, which are the basis of the etiology and variable expressivity of HPA, relying on the analysis of gene mutations responsible of the disease in patients from Southern Italy. Genotyping of patients with elevated Phe levels detected in newborn screening is often performed to complete diagnosis. From these data, we also correlated genotypes with predicted residual activities (PRA) from in vitro expression experiments tabulated in PAHdb (http://www.pahdb.mcgill.ca/), performing a genotype–phenotype correlation. The molecular bases of PKU and their implications at the metabolic level with focus on BH4 responsiveness were addressed in the final section of thesis. The quantification of PAH activity expressed in cultured cells was performed by a tandem mass spectrometry assay at the section of Dietmar-Hopp-Metabolic Center of Universitatsklinikum of Heidelberg (Germany). Mass spectrometry allows the use of stable isotopes for Phe and Tyr quantification and PAH activity measurement of PKU mutations. In summary, the data obtained in this study on the frequency and distribution of mutations in the PAH gene reinforce the idea of considerable heterogeneity of mutations in patients HPA, with particular reference to Southern Italy. This work has also led to the conclusion that the genotype is the main determinant of the biochemical phenotype in most patients with PAH deficiency and has greater value in estimation of BH4-responsiveness. In addition, calculating the residual PAH activity from the information obtained from our in vitro experiments and those available in the database may be useful for predicting and/or exclusion of potential candidates for BH4 therapy. The results presented herein provide then a clarification on PKU genotypes, on phenotypes, and response to BH4 as a reference available for clinicians, health care professionals and researchers for diagnosis and establishment of tailored treatment of patients. A significant number of PKU patients is likely to benefit from BH4 treatment which, combined with a less strict diet, or in some cases as monotherapy, may reduce nutritional deficiencies and neurological and psychological dysfunctions, contributing to a better quality of life of these patients.

L’Iperfenilalaninemia (HPA), una malattia genetica autosomica recessiva, è il risultato di un difetto dell’attività dell’enzima Fenilalanina Idrossilasi (PAH), con conseguente accumulo plasmatico di Fenilalanina. Nella maggior parte dei casi (circa il 98%) l’espressione fenotipica della patologia è il risultato della presenza di mutazioni a carico del gene PAH, codificante per l’enzima fenilalanina idrossilasi, con locus 12q24.1 sul cromosoma 12. La patologia ha una frequenza nella popolazione caucasica di circa 1 ogni 10.000, corrispondente ad una frequenza di portatori di circa 1 a 50; la maggior parte degli individui affetti sono identificati nel periodo neonatale mediante programmi di screening (obbligatori in diversi Paesi, quali l'Italia) sulla popolazione generale. La HPA è espressa con una significativa variabilità di espressione fenotipica e con differenti gradi di gravità. La terapia alimentare, basata su una ristretta assunzione di fenilalanina, previene i danni neurologici. I fenotipi dell’Iperfenilalaninemia sono definiti in base ai livelli di fenilalanina nel sangue alla nascita: Fenilchetonuria classica (PKU), con valori di fenilalanina nel plasma >1200 μmol/L (>20mg/dl); forma lieve di PKU con livelli di fenilalaninemia compresi tra 600 and 1200 μmol/L (10-20 mg/dl); Iperfenilalaninemia non-PKU (HPA- non PKU o MHP) quando i valori di fenilalaninemia sono al di sotto di 600 μmol/L (<10 mg/dl). Ad oggi, tramite l’analisi molecolare del gene PAH, sono state individuate circa 600 mutazioni (la maggior parte di tipo missenso) e oltre il 50% in condizione di eterozigosi composita. Il numero considerevole di mutazioni individuate rappresenta una consistente evidenza di eterogeneità allelica alla base della patologia che ne giustifica l’espressività variabile (anche nell’ambito di una stessa famiglia). Il progetto ha avuto, innanzitutto, l’obiettivo di incrementare le conoscenze sui meccanismi molecolari e biochimici, ancora oggi non del tutto noti, che sono alla base dell’eziopatogenesi ed espressività variabile dell’HPA basandoci su un'attenta analisi delle mutazioni responsabili della patologia in pazienti provenienti dal Sud Italia. La caratterizzazione genotipica dei pazienti con elevati livelli di Phe individuati con lo screening neonatale viene spesso eseguita per completare la diagnosi. Da questi dati, abbiamo anche correlato i genotipi con le attività enzimatiche residue (PRA) ottenute in esperimenti di espressione in vitro ed elencate nel database PAHdb (http://www.pahdb.mcgill.ca/), eseguendo una correlazione genotipo-fenotipo. Nella sezione finale della tesi, si è puntato l’attenzione sulle implicazioni della PKU a livello metabolico, con particolare attenzione alla risposta al BH4: la quantificazione dell’attività dell’enzima PAH, espresso in cellule in coltura, è stata eseguita tramite la tecnica della spettrometria di massa tandem presso la sezione di malattie metaboliche della clinica universitaria di Heidelberg (Germania). La spettrometria di massa consente l'uso di isotopi stabili per la quantificazione della fenilalanina e della tirosina e la misura dell'attività dell’enzima PAH delle mutazioni PKU, consentendo di testare e predire la loro risposta al BH4 in un sistema cellulare di mammifero. In sintesi, i dati ottenuti in questo studio sulla frequenza e la distribuzione delle mutazioni del gene PAH rafforzano l’idea della notevole eterogeneità delle mutazioni nei pazienti HPA, con particolare riferimento al Sud Italia. Questo lavoro ha portato anche alla conclusione che il genotipo è il principale determinante del fenotipo biochimico nella maggior parte dei pazienti con deficit di PAH ed ha un grande valore nel determinare la risposta al cofattore. Inoltre, il calcolo dell’attività residua enzimatica proveniente dalle informazioni ottenute dai nostri esperimenti in vitro e da quelle disponibili nel database potrebbe essere utile per la previsione e/o l'esclusione di potenziali candidati per la terapia con BH4. I risultati qui presentati forniscono quindi una delucidazione sui genotipi PKU, sui fenotipi, e sulla risposta al BH4 come riferimento per i medici, operatori sanitari e ricercatori per la diagnosi e la definizione di un trattamento su misura dei pazienti. Un numero significativo di pazienti affetti da PKU potrebbero trarre beneficio dalla terapia col BH4 che, combinata con una dieta meno rigida, o usata in casi particolari come monoterapia, potrebbe ridurre al minimo le carenze nutrizionali e le disfunzioni neurologiche e psicologiche, contribuendo ad una migliore qualità di vita di questi pazienti.