Proteomics-Based Characterization of Food Allergens and Effects from Food Processing

Food contains a lot of proteins, but only a small fraction of them are allergens either in their native forms or in products resulting from food processing. There is a need for sensitive and rapid methods for detecting the presence of allergens in foods, as well as analyse the modifications induced by food processing. This research is important if we realize the potential of new analitycal strategies andnovel processing techniques that may reduce the allergenicity of foods. Nowadays, mass Spectrometry and Liquid Chromatography (LC) are extensively used for the characterization of allergenic proteins and peptides: the application of proteomics for the analysis of allergenic proteins has been recently termed allergenomics. Unfortunately, the variability of food allergens makes it difficult to develop a generic and universal method for their characterization. A major challenge for MS techniques is sample preparation and its related issues, as in the case of Apiaceae allergens, for many of which there is a lack of reference materials and methodologies. This PhD thesis research project aimed to make a contribution for the determination of food allergens by LCMS and to evaluate the effect of some food processing on allergenicity of food through nanoliquid chromatography and electrospray ionization-ion trap mass spectrometry (nanoHPLC-ESI-IT-MSn). A specific bioinformatic approach was developed, in order to characterize the most important food allergens from soft cheese and plant samples from the Apiaceae family and to describe the effects to the allergenic potential of soft cheese samples during several conditioning systems. In this work, the peptides FVAPFPEVF from cow’s milk (CM) allergen Bos d 9 and the peptide QEPVLGPVRGPFPIIV from CM allergen Bos d 11 were identified and proposed as valid marker peptides for CM allergens detection and for future analysis in this field, e.g. for quantification purposes. In addition, the results demonstrated the effect of some packaging conditions on reducing the total allergenic power of soft cheese, and showed the condition treatment S1 (based on potassium sorbate) as an optimal solution for reducing the total potential of soft cheese, both in terms of allergenic intensity and in terms of allergen variability. Using a similar strategy, several experiments were also performed for detecting the presence of Apiaceae allergens from plant samples and to characterize one or more potential markers for their detection in food using LCMS. Among those, the hydrophilic peptide FYETKDTDILAAFR from the allergen Spi o Rubisco is proposed as a potential marker for routine detection of Apiaceae allergens in food through ESI-MSn. Other aspects regarding this allergen should be investigated, such as its behaviour under food processing and its role in the allergenic reactions (epitope mapping). In this last step, a particular attention was given to the sample preparation and to the selection of eco-compatible extraction buffers, and to the overall optimization of LCMS experimental conditions.

Solo una piccola parte dell’enorme quantità di proteine presenti negli alimenti è allergenica, sia nella loro forma nativa sia nelle modifiche derivanti dai processi alimentari. È necessario sviluppare metodi analitici sensibili e veloci per rilevare la presenza di allergeni negli alimenti, nonché analizzare le modifiche indotte dai processi. Questa tipo di ricerca è importante se pensiamo agli sviluppi di nuove strategie analitiche a supporto della riduzione del potenziale allergenico degli alimenti. Oggigiorno, la spettrometria di massa e la cromatografia liquida (LCMS) sono ampiamente utilizzate per la caratterizzazione di proteine e peptidi allergenici, infatti è stato recentemente coniato il termine “allergenomica” per descrivere l’applicazione della proteomica all’analisi di allergeni. Tuttavia, la variabilità degli allergeni alimentari rende difficile sviluppare un metodo generico e universale per la loro caratterizzazione. Una sfida importante per le tecniche di MS è la preparazione del campione e gli aspetti correlati, come avviene ad esempio per gli allergeni da Apiaceae, per molti dei quali vi è una carenza di riferimenti e metodologie. Questo progetto di ricerca mira a dare un contributo alla determinazione degli allergeni alimentari tramite LCMS e a valutare l'effetto di alcuni processi sul potenziale allergenico del cibo attraverso cromatografia liquida nano hplc e spettrometria di massa in trappola ionica con sorgente di ionizzazione elettrospray (nanoHPLC-ESI-IT-MSn). Un approccio bioinformatico dedicato è stato sviluppato al fine di individuare i più importanti allergeni alimentari da formaggio spalmabile e da campioni vegetali della famiglia delle Apiaceae e allo scopo di descrivere gli effetti di diversi sistemi di condizionamento sul potenziale allergenico del formaggio spalmabile. In questo lavoro, il peptide FVAPFPEVF dell’ allergene di latte vaccino Bos d 9 e il peptide QEPVLGPVRGPFPIIV dell’allergene Bos d 11 sono stati identificati e proposti per la rilevazione di allergeni del latte e per le analisi future in questo campo come ad esempio per scopi di quantificazione. Inoltre, i risultati hanno dimostrato l'effetto di alcune tecniche di condizionamento sulla riduzione del potere allergenico totale del formaggio spalmabile, e hanno rilevato il trattamento il trattamento S1 (basato su sorbato di potassio) come una soluzione ottimale per ridurre la potenziale allergenicità di questo prodotto, sia in termini di intensità che in termini di variabilità allergeniche. Utilizzando una strategia simile, diversi esperimenti sono stati eseguiti per rilevare la presenza di allergeni di Apiaceae da campioni vegetali e caratterizzare uno o più potenziali marcatori per la loro rilevazione dal cibo utilizzando tecniche di LCMS. Tra questi, il peptide idrofilo FYETKDTDILAAFR dell’allergene Spi o Rubisco viene proposto come potenziale marcatore per il rilevamento di routine di allergeni da Apiaceae attraverso ESI-MSn. In questo caso altri aspetti riguardanti questo allergene dovrebbero essere studiati, come gli effetti da processi alimentari e il suo ruolo nelle reazioni allergiche (caratterizzazione degli epitopi). In quest'ultima fase, una particolare attenzione è stata prestata alla preparazione del campione e alla selezione di tamponi estraenti eco-compatibili, e alla ottimizzazione globale delle condizioni sperimentali dell’analisi LCMS.