1α,25-dihydroxyvitamin D3 (1,25(OH)2D3), the active metabolite of Vitamin D (Vit D), increases intestinal absorption of calcium and phosphate, maintaining a correct balance of bone remodeling. Vit D has an anabolic effect on the skeletal system and is key in promoting osteoblastic differentiation of human Mesenchymal Stem Cells (hMSCs) from bone marrow. In order to overcome some negative aspects connected with the use of MSCs from bone marrow, i.e. morbidity, pain and low yield of cells, other sources of MSCs have been examined. MSCs can be also isolated from the immature form of the tooth, the dental bud: Dental Bud Stem Cells (DBSCs) are adult stem cells that can effectively undergo osteoblastic differentiation. The aim of the project is to study the effect of Vit D on DBSCs, which represent a useful model to understand the anabolic activity of the bone cells, starting from very undifferentiated osteoblast precursors. Since MSCs adhesion to Extra Cellular Matrix (ECM) is still poorly characterized, as well as ECM proteins role in regulating osteogenic differentiation, we studied our cell model of DBSCs for the expression of Integrins and Cadherins as well as for ECM protein interaction. We demonstrated a functional osteogenic differentiation of DBSCs towards an osteoblastic phenotype, being incremented by the Vit D treatment. We observed that DBSCs treated with 1,25(OH)2D3, expressed increased levels of the main osteoblastic markers and formed mineralized matrix nodules in vitro. These results reflected the mesenchymal origin of DBSCs and confirmed their osteoblast-like features. Moreover, in order to elucidate the effect of the microenvironment on DBSCs behavior, we also analyzed αVβ3 integrin distribution and Focal Adhesion formation in cells seeded on surfaces with different coatings in the presence of Vit D. We observed that Vit D seems to induce the expression of focal adhesions in our cell model. Our observations suggest that Vit D acts directly on these cells, that can be considered osteoblast precursors, directing them to an increased bone formation.

1α, 25-diidrossivitamina D3 (1,25(OH)2D3), il metabolita attivo della Vitamina D (Vit D), aumenta l'assorbimento intestinale di calcio e fosfato, mantenendo un corretto bilanciamento nel rimodellamento osseo. La Vit D ha un effetto anabolizzante sul sistema scheletrico ed è fondamentale nel promuovere il differenziamento osteoblastico di cellule staminali mesenchimali umane (hMSCs) isolate da midollo osseo. Al fine di superare alcuni aspetti negativi associati all'utilizzo di MSCs da midollo osseo quali morbilità, dolore e bassa resa di cellule, sono state studiate fonti alternative di tali cellule. Le MSCs possono essere isolate anche dal dente nella sua forma immatura, il germoglio dentale: le Cellule Staminali da Gemma Dentale (Dental Bud Stem Cells - DBSCs) sono cellule staminali adulte che possono effettivamente differenziare in senso osteoblastico. Lo scopo del progetto è quello di studiare l'effetto della Vit D sulle DBSCs, che rappresentano un modello utile per comprendere l'attività anabolica delle cellule ossee a partire da precursori osteoblastici molto indifferenziati. Dal momento che l'adesione delle MSCs alla Matrice Extra Cellulare (ECM) è ancora poco caratterizzata, così come il ruolo delle proteine della ECM nella regolazione del differenziamento osteogenico, abbiamo innanzitutto studiato il nostro modello cellulare di DBSCs per l'espressione di Integrine e Caderine così come per l'interazione con proteine della ECM. Abbiamo osservato che le DBSCs mostrano un modello di adesione molecolare paragonabile a quello descritto per le MSCs. Abbiamo dimostrato una differenziazione delle DBSCs in senso osteogenico con acquisizione di un fenotipo osteoblastico, incrementata dal trattamento con la Vit D. Abbiamo osservato che le DBSCs, trattate con 1,25(OH)2D3, esprimevano livelli più elevati dei principali marcatori osteoblastici e formavano noduli di matrice mineralizzata in vitro. Questi risultati riflettono l'origine mesenchimale delle DBSCs e confermano le loro caratteristiche osteoblastiche. Inoltre, al fine di chiarire l'effetto del microambiente sul comportamento delle DBSCs, abbiamo analizzato anche la distribuzione dell’integrina αVβ3 e la formazione di Adesioni Focali (FAs) in cellule seminate su superfici con diversi rivestimenti in presenza di Vit D. Abbiamo quindi osservato che la Vit D sembra indurre l’espressione di tali adesioni focali nel nostro modello cellulare. Le nostre osservazioni suggeriscono che la Vit D sia in grado di agire direttamente su queste cellule, che possono essere considerate dei precursori degli osteoblasti, indirizzandole verso una formazione ossea più elevata.

Vitamin d and nanostructured surfaces in osteoblastic differentiation of dental stem cells

POSA, FRANCESCA
2017

Abstract

1α, 25-diidrossivitamina D3 (1,25(OH)2D3), il metabolita attivo della Vitamina D (Vit D), aumenta l'assorbimento intestinale di calcio e fosfato, mantenendo un corretto bilanciamento nel rimodellamento osseo. La Vit D ha un effetto anabolizzante sul sistema scheletrico ed è fondamentale nel promuovere il differenziamento osteoblastico di cellule staminali mesenchimali umane (hMSCs) isolate da midollo osseo. Al fine di superare alcuni aspetti negativi associati all'utilizzo di MSCs da midollo osseo quali morbilità, dolore e bassa resa di cellule, sono state studiate fonti alternative di tali cellule. Le MSCs possono essere isolate anche dal dente nella sua forma immatura, il germoglio dentale: le Cellule Staminali da Gemma Dentale (Dental Bud Stem Cells - DBSCs) sono cellule staminali adulte che possono effettivamente differenziare in senso osteoblastico. Lo scopo del progetto è quello di studiare l'effetto della Vit D sulle DBSCs, che rappresentano un modello utile per comprendere l'attività anabolica delle cellule ossee a partire da precursori osteoblastici molto indifferenziati. Dal momento che l'adesione delle MSCs alla Matrice Extra Cellulare (ECM) è ancora poco caratterizzata, così come il ruolo delle proteine della ECM nella regolazione del differenziamento osteogenico, abbiamo innanzitutto studiato il nostro modello cellulare di DBSCs per l'espressione di Integrine e Caderine così come per l'interazione con proteine della ECM. Abbiamo osservato che le DBSCs mostrano un modello di adesione molecolare paragonabile a quello descritto per le MSCs. Abbiamo dimostrato una differenziazione delle DBSCs in senso osteogenico con acquisizione di un fenotipo osteoblastico, incrementata dal trattamento con la Vit D. Abbiamo osservato che le DBSCs, trattate con 1,25(OH)2D3, esprimevano livelli più elevati dei principali marcatori osteoblastici e formavano noduli di matrice mineralizzata in vitro. Questi risultati riflettono l'origine mesenchimale delle DBSCs e confermano le loro caratteristiche osteoblastiche. Inoltre, al fine di chiarire l'effetto del microambiente sul comportamento delle DBSCs, abbiamo analizzato anche la distribuzione dell’integrina αVβ3 e la formazione di Adesioni Focali (FAs) in cellule seminate su superfici con diversi rivestimenti in presenza di Vit D. Abbiamo quindi osservato che la Vit D sembra indurre l’espressione di tali adesioni focali nel nostro modello cellulare. Le nostre osservazioni suggeriscono che la Vit D sia in grado di agire direttamente su queste cellule, che possono essere considerate dei precursori degli osteoblasti, indirizzandole verso una formazione ossea più elevata.
1α,25-dihydroxyvitamin D3 (1,25(OH)2D3), the active metabolite of Vitamin D (Vit D), increases intestinal absorption of calcium and phosphate, maintaining a correct balance of bone remodeling. Vit D has an anabolic effect on the skeletal system and is key in promoting osteoblastic differentiation of human Mesenchymal Stem Cells (hMSCs) from bone marrow. In order to overcome some negative aspects connected with the use of MSCs from bone marrow, i.e. morbidity, pain and low yield of cells, other sources of MSCs have been examined. MSCs can be also isolated from the immature form of the tooth, the dental bud: Dental Bud Stem Cells (DBSCs) are adult stem cells that can effectively undergo osteoblastic differentiation. The aim of the project is to study the effect of Vit D on DBSCs, which represent a useful model to understand the anabolic activity of the bone cells, starting from very undifferentiated osteoblast precursors. Since MSCs adhesion to Extra Cellular Matrix (ECM) is still poorly characterized, as well as ECM proteins role in regulating osteogenic differentiation, we studied our cell model of DBSCs for the expression of Integrins and Cadherins as well as for ECM protein interaction. We demonstrated a functional osteogenic differentiation of DBSCs towards an osteoblastic phenotype, being incremented by the Vit D treatment. We observed that DBSCs treated with 1,25(OH)2D3, expressed increased levels of the main osteoblastic markers and formed mineralized matrix nodules in vitro. These results reflected the mesenchymal origin of DBSCs and confirmed their osteoblast-like features. Moreover, in order to elucidate the effect of the microenvironment on DBSCs behavior, we also analyzed αVβ3 integrin distribution and Focal Adhesion formation in cells seeded on surfaces with different coatings in the presence of Vit D. We observed that Vit D seems to induce the expression of focal adhesions in our cell model. Our observations suggest that Vit D acts directly on these cells, that can be considered osteoblast precursors, directing them to an increased bone formation.
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