Abstract La malattia di Alzheimer è la forma più comune di demenza degenerativa progressivamente invalidante con esordio prevalentemente in età presenile. Si stima che circa il 60-70% dei casi di demenza sia dovuta a Alzheimer disease (AD). AD è una patologia multifattoriale caratterizzata sia da placche senili extracellulari, costituite dall’accumulo della proteina amiloide, sia da grovigli neurofibrillari intracellulari, composti da filamenti Tau patologici (NFTs). Inoltre nell’Alzheimer vi è anche perdita neuronale soprattutto a livello delle aree cerebrali che sottendono i processi di apprendimento e memoria, come per esempio la corteccia frontale e l’ippocampo. L’eziologia dell’AD sembra essere legata a vari meccanismi che non sono stati ancora completamente chiariti. Allo stato attuale, non esistono terapie in uso clinico in grado di influenzare efficacemente il decorso della malattia. Alla luce della complessità della patologia e ovvio pensare che i nuovi farmaci, per essere ritenuti farmacologicamente promettenti, dovrebbero agire contemporaneamente sui vari meccanismi patogenetici coinvolti nell’AD. A tal proposito, l'obiettivo di questo progetto di ricerca è stato quello di verificare se la Palmitoiletanolamide (PEA) è in grado di modulare i sintomi presenti nella malattia di Alzheimer. Per gli obiettivi del progetto, è stato utilizzato un modello transgenico murino della patologia di Alzheimer ed il rispettivo gruppo controllo, non transgenico (NonTg). I topi transgenici, creati nei laboratori del prof. La Ferla (University of California, Irvine, USA) hanno tre geni umani mutanti (APPswe, PS1M146V, e tauP301L), per questo indicati come 3×Tg-AD, e sono considerati tra i modelli animali di malattia di Alzheimer che meglio simulano la patologia riscontrata nell’uomo. Infatti, i 3×Tg-AD sono in grado di sviluppare le placche amiloidi e NTF in maniera tempo dipendente, nelle regioni target del cervello, simulando così la progressione della malattia riscontrata negli esseri umani. Nel nostro protocollo sperimentale, topi a 3 mesi (che presentavano i primi segni di alterazioni neuropatologiche) e 9 mesi (che presentavano evidenti segni di alterazioni neuropatologiche) di vita sono stati trattati con Palmitoiletanolamide (PEA) per 90 giorni e, alla fine del trattamento cronico, i topi sono stati sottoposti a diversi test comportamentali per valutare un eventuale effetto sui deficit cognitivi e non cognitivi riscontrati nel modello transgenico preso in esame. Alla fine dei test comportamentali gli animali sono stati sacrificati per determinare, mediante analisi di biologia molecolare, l'effetto del trattamento sulle alterazioni istopatologiche tipiche della AD. I risultati dello studio hanno dimostrato che la PEA è in grado di migliorare le funzioni cognitive e non cognitive nei topi 3×Tg-AD a 6 mesi di vita, mentre sui topi a 12 mesi di vita ha mostrato un miglioramento significativo solo sulla memoria a breve termine. Circa gli effetti della PEA sulla patologia Aβ e tau nei topi 3xTg-AD, lo studio ha dimostrato che la PEA riduce in modo significativo i livelli di APP nella corteccia di topi 3×Tg-AD a 6 mesi e, cosa ancor più interessante, diminuisce anche i livelli di Aβ*56, un oligomero di Aβ. Inoltre, il trattamento cronico con PEA ha indotto una significativa riduzione della fosforilazione di tau nei residui di fosforilazione 202/205. Questi risultati suggeriscono, pertanto, che il miglioramento delle funzioni cognitive e non cognitive potrebbe essere ascritto alle variazioni sui livelli complessivi di Aβ e di tau indotti dal trattamento cronico con PEA. Inoltre, non abbiamo trovato cambiamenti significativi nei topi 3×Tg-AD per quanto riguarda i marcatori neuroinfiammatori presi in considerazione, come, ad esempio, COX-2 o marcatori di attivazione astrocitari e/o microgliali. Certamente ulteriori studi saranno necessari per determinare i meccanismi molecolari alla base degli effetti della PEA. In conclusione, i nostri dati indicano che il trattamento cronico con PEA potrebbe essere efficace nelle fasi precoci della patologia, ovvero quando l’accumulo di Aβ è nelle sue fasi iniziali ed i danni nel sistema nervoso centrale sono ancora lievi. Abstract in English Alzheimer’s disease (AD) is the most common form of dementia affecting elderly people. AD is a multifaceted pathology characterized by accumulation of extracellular neuritic plaques, intracellular neurofibrillary tangles (NFTs) and neuronal loss mainly in the cortex and hippocampus. AD etiology appears to be linked to a multitude of mechanisms that have not been yet completely elucidated. At present, no therapies in clinical use are able to effectively impact the disease course. Therefore, new drugs able to simultaneously ameliorate the numerous pathogenic mechanism involved in AD are therapeutically promising.To this regard, the aim of this research project was to investigate whether the Palmitoylethanolamide (PEA), an endogenous fatty acid amide, might modulate the symptoms of the AD. To this aim, the triple transgenic mouse model of AD (3xTg-AD) and wild type littermate (NonTg) have been used. The 3×Tg-AD mice harbor three mutant human genes (APPswe, PS1M146V, and tauP301L) and are one of the most thoroughly characterized model of AD. The 3×Tg-AD mice develop amyloid plaques and NTF pathology in a hierarchical manner in AD-relevant brain regions, and closely mimic the disease progression in humans. The mice at 3-months and 9-months of age have been treated with PEA for 90 days and, at the end of treatment, they were subjected to different behavioral tests in order to investigate their mood and learning/memory domains. At the end of behavioral tests the animals were sacrified to determine, by biochemical analyses, the effect of treatment on neuropathological and neuroinflammatory hallmarks. Interestingly PEA is able to improve cognitive and non-cognitive functions in 3×Tg-AD at 6 months of age, while has only effect on short-term memory in transgenic mice at 12 months of age. The present work provides also an extensive investigation of the effect of PEA treatment on the onset and progression of Aβ and tau pathology in 3×Tg-AD mice. We showed that PEA significantly reduces the levels of full-length APP in cortex of 6-month-old 3×Tg-AD mice and, more interestingly, it decreases also the levels of Aβ*56, an Aβ oligomer. Similarly, PEA treatment is able to reduce steady-state levels of full-length APP also in 3×Tg-AD mice at 12 months of age, suggesting that it could modulate APP processing in these animals. Interestingly, PEA treatment is also associated with a significant reduction in tau phosphorylation at residues 202/205. These results suggest that cognitive improvement is probably due to changes in overall Aβ levels and tau pathology or to a mixture of both hallmarks. Furthermore, we did not find significant changes in almost all neuroinflammatory markers taken into account, such as COX-2 or in microglial/astrocytic activation markers. Although further studies are needed to determine the molecular mechanisms underlying the beneficial effects of PEA against AD neuropathology, our data indicate that the compound may be effective in early AD or when Aβ is accumulating and initiating damage in the central nervous system.

Behavioral and neurochemical effects of Palmitoylethanolamide in a murine model of Alzheimer’s Disease

PACE, LORENZO
2016

Abstract

Abstract La malattia di Alzheimer è la forma più comune di demenza degenerativa progressivamente invalidante con esordio prevalentemente in età presenile. Si stima che circa il 60-70% dei casi di demenza sia dovuta a Alzheimer disease (AD). AD è una patologia multifattoriale caratterizzata sia da placche senili extracellulari, costituite dall’accumulo della proteina amiloide, sia da grovigli neurofibrillari intracellulari, composti da filamenti Tau patologici (NFTs). Inoltre nell’Alzheimer vi è anche perdita neuronale soprattutto a livello delle aree cerebrali che sottendono i processi di apprendimento e memoria, come per esempio la corteccia frontale e l’ippocampo. L’eziologia dell’AD sembra essere legata a vari meccanismi che non sono stati ancora completamente chiariti. Allo stato attuale, non esistono terapie in uso clinico in grado di influenzare efficacemente il decorso della malattia. Alla luce della complessità della patologia e ovvio pensare che i nuovi farmaci, per essere ritenuti farmacologicamente promettenti, dovrebbero agire contemporaneamente sui vari meccanismi patogenetici coinvolti nell’AD. A tal proposito, l'obiettivo di questo progetto di ricerca è stato quello di verificare se la Palmitoiletanolamide (PEA) è in grado di modulare i sintomi presenti nella malattia di Alzheimer. Per gli obiettivi del progetto, è stato utilizzato un modello transgenico murino della patologia di Alzheimer ed il rispettivo gruppo controllo, non transgenico (NonTg). I topi transgenici, creati nei laboratori del prof. La Ferla (University of California, Irvine, USA) hanno tre geni umani mutanti (APPswe, PS1M146V, e tauP301L), per questo indicati come 3×Tg-AD, e sono considerati tra i modelli animali di malattia di Alzheimer che meglio simulano la patologia riscontrata nell’uomo. Infatti, i 3×Tg-AD sono in grado di sviluppare le placche amiloidi e NTF in maniera tempo dipendente, nelle regioni target del cervello, simulando così la progressione della malattia riscontrata negli esseri umani. Nel nostro protocollo sperimentale, topi a 3 mesi (che presentavano i primi segni di alterazioni neuropatologiche) e 9 mesi (che presentavano evidenti segni di alterazioni neuropatologiche) di vita sono stati trattati con Palmitoiletanolamide (PEA) per 90 giorni e, alla fine del trattamento cronico, i topi sono stati sottoposti a diversi test comportamentali per valutare un eventuale effetto sui deficit cognitivi e non cognitivi riscontrati nel modello transgenico preso in esame. Alla fine dei test comportamentali gli animali sono stati sacrificati per determinare, mediante analisi di biologia molecolare, l'effetto del trattamento sulle alterazioni istopatologiche tipiche della AD. I risultati dello studio hanno dimostrato che la PEA è in grado di migliorare le funzioni cognitive e non cognitive nei topi 3×Tg-AD a 6 mesi di vita, mentre sui topi a 12 mesi di vita ha mostrato un miglioramento significativo solo sulla memoria a breve termine. Circa gli effetti della PEA sulla patologia Aβ e tau nei topi 3xTg-AD, lo studio ha dimostrato che la PEA riduce in modo significativo i livelli di APP nella corteccia di topi 3×Tg-AD a 6 mesi e, cosa ancor più interessante, diminuisce anche i livelli di Aβ*56, un oligomero di Aβ. Inoltre, il trattamento cronico con PEA ha indotto una significativa riduzione della fosforilazione di tau nei residui di fosforilazione 202/205. Questi risultati suggeriscono, pertanto, che il miglioramento delle funzioni cognitive e non cognitive potrebbe essere ascritto alle variazioni sui livelli complessivi di Aβ e di tau indotti dal trattamento cronico con PEA. Inoltre, non abbiamo trovato cambiamenti significativi nei topi 3×Tg-AD per quanto riguarda i marcatori neuroinfiammatori presi in considerazione, come, ad esempio, COX-2 o marcatori di attivazione astrocitari e/o microgliali. Certamente ulteriori studi saranno necessari per determinare i meccanismi molecolari alla base degli effetti della PEA. In conclusione, i nostri dati indicano che il trattamento cronico con PEA potrebbe essere efficace nelle fasi precoci della patologia, ovvero quando l’accumulo di Aβ è nelle sue fasi iniziali ed i danni nel sistema nervoso centrale sono ancora lievi. Abstract in English Alzheimer’s disease (AD) is the most common form of dementia affecting elderly people. AD is a multifaceted pathology characterized by accumulation of extracellular neuritic plaques, intracellular neurofibrillary tangles (NFTs) and neuronal loss mainly in the cortex and hippocampus. AD etiology appears to be linked to a multitude of mechanisms that have not been yet completely elucidated. At present, no therapies in clinical use are able to effectively impact the disease course. Therefore, new drugs able to simultaneously ameliorate the numerous pathogenic mechanism involved in AD are therapeutically promising.To this regard, the aim of this research project was to investigate whether the Palmitoylethanolamide (PEA), an endogenous fatty acid amide, might modulate the symptoms of the AD. To this aim, the triple transgenic mouse model of AD (3xTg-AD) and wild type littermate (NonTg) have been used. The 3×Tg-AD mice harbor three mutant human genes (APPswe, PS1M146V, and tauP301L) and are one of the most thoroughly characterized model of AD. The 3×Tg-AD mice develop amyloid plaques and NTF pathology in a hierarchical manner in AD-relevant brain regions, and closely mimic the disease progression in humans. The mice at 3-months and 9-months of age have been treated with PEA for 90 days and, at the end of treatment, they were subjected to different behavioral tests in order to investigate their mood and learning/memory domains. At the end of behavioral tests the animals were sacrified to determine, by biochemical analyses, the effect of treatment on neuropathological and neuroinflammatory hallmarks. Interestingly PEA is able to improve cognitive and non-cognitive functions in 3×Tg-AD at 6 months of age, while has only effect on short-term memory in transgenic mice at 12 months of age. The present work provides also an extensive investigation of the effect of PEA treatment on the onset and progression of Aβ and tau pathology in 3×Tg-AD mice. We showed that PEA significantly reduces the levels of full-length APP in cortex of 6-month-old 3×Tg-AD mice and, more interestingly, it decreases also the levels of Aβ*56, an Aβ oligomer. Similarly, PEA treatment is able to reduce steady-state levels of full-length APP also in 3×Tg-AD mice at 12 months of age, suggesting that it could modulate APP processing in these animals. Interestingly, PEA treatment is also associated with a significant reduction in tau phosphorylation at residues 202/205. These results suggest that cognitive improvement is probably due to changes in overall Aβ levels and tau pathology or to a mixture of both hallmarks. Furthermore, we did not find significant changes in almost all neuroinflammatory markers taken into account, such as COX-2 or in microglial/astrocytic activation markers. Although further studies are needed to determine the molecular mechanisms underlying the beneficial effects of PEA against AD neuropathology, our data indicate that the compound may be effective in early AD or when Aβ is accumulating and initiating damage in the central nervous system.
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