Role of the Heat Shock Protein 75 (TRAP1) in Colon and Thyroid cancer progression

Abstract I tumori umani caratterizzati da mutazioni della proteina chinasi BRAF, sono patologie aggressive con un andamento clinico sfavorevole e resistenza alla terapia. TRAP1 è un chaperone molecolare appartenente alla famiglia delle Heat Shock Protein 90 (HSP90) la cui espressione è alterata nei tumori umani. Nel contesto neoplastico, TRAP1 ha la funzione di regolare il metabolismo cellulare proteggendo la cellula tumorale dall’apoptosi indotta dai chemioterapici. Le funzioni svolte dalla proteina TRAP1 avvengono principalmente attraverso un controllo qualitativo su specifiche proteine indicate con il nome di “proteine clienti”. L’ipotesi che TRAP1 ha un ruolo nel regolare la funzione della proteina chinasi BRAF, deriva dall’osservazione preliminare che i livelli della proteina BRAF sono ridotti dopo il silenziamento di TRAP1 in cellule umane di carcinoma mammario e del colon retto in vitro ed in vivo. Questo studio evidenzia che TRAP1 è coinvolto nella regolazione della sintesi e della ubiquitinazione della proteina chinasi BRAF senza influenzare la stabilità di quest'ultima. Infatti, la sintesi della proteina BRAF è facilitata quando TRAP1 è espresso ad alti livelli, mentre un aumento della ubiquitinazione di BRAF è stato osservato dopo distruzione del network di TRAP1. Inoltre, il pathway di BRAF è modulato dall’attività di TRAP1 dato che il silenziamento di TRAP1 induce una riduzione della fosforilazione di ERK ed una inibizione del ciclo cellulare con conseguente accumulo delle cellule nella fase G0–G1 o G2–M del ciclo cellulare. Di particolare rilievo è il dato che evidenzia come la regolazione della chinasi BRAF da parte di TRAP1 è conservata nei carcinomi umani del colon retto nei quali inoltre le due proteine sono coespresse. Ulteriormente, l’impiego dell’inibitore farmacologico di TRAP1 e di HSP90 noto con il nome di HSP990, ha mostrato una elevata attività sul network di TRAP1 ed un potente effetto citostatico in cellule umane di carcinoma del colon retto recanti la mutazione BRAFV600E. Quindi la funzione di TRAP1 evidenziata in questo studio, rappresenta una nuova potenziale finestra terapeutica nei tumori umani caratterizzati dall’espressione dell’oncogene BRAFV600E e resisetnza alla convenzionale terapia farmacologica. Un ulteriore scopo di questo lavoro, considerato il ruolo svolto da TRAP1 nella carcinogenesi umana emerso negli ultimi anni, è stato quello di studiare l’espressione di TRAP1 in una coorte di carcinomi toridei (CT) umani di grado ben differenziato, scarsamente differenziato ed anaplastico. Infine, è stato valutato in vitro, l' effetto di TRAP1 nella protezione dall’apoptosi e nella proliferazione cellulare in linee umane di CT. I risultati ottenuti, indicano che l’espressione di TRAP1 aumenta progressivamente rispetto alla tiroide normale peritumorale, nel passaggio dal carcinoma tiroideo papillare ben differenziato, alla variante più aggressiva di quest'ultimo il carcinoma tiroideo papillare variante follicolare fino al carcinoma scarsamente differenziato. I carcinomi anaplastici della tiroide sono caratterizzati invece da un doppio modello di espressione di TRAP1. La maggioranza di essi, esprime alti livelli di TRAP1 mentre un piccolo sottogruppo è caratterizzato da completa assenza nell’espressione di TRAP1. Coerentemente con il potenziale coinvolgimento di TRAP1 nella progressione del carcinoma tiroideo, il silenziamento transiente di TRAP1 in linee umane di CT induce aumento della sensitività all’apoptosi indotta dal paclitaxel, inbizione della progressione del ciclo cellulare e riduzione del signaling di ERK1/2 MAPK. Di particolare interesse sono i dati ottenuti su linee di CT umane soggette all'effetto di inibitori farmacologici dell'attività di TRAP1. Tali dati indicano una significativa inibizione della proliferazione cellulare, riduzione del signaling di ERK1/2 MAPK e concomitante ripristino della sensibilità ad agenti chemioterapici. Questi dati suggeriscono dunque che l’aumentata espressione di TRAP1 è coinvolta nella progressione del carcinoma tiroideo e che l’inibizione di TRAP1 potrebbe rappresentare un potenziale target terapeutico per ridurre la proliferazione cellulare e la resistenza all'apoptosi nei CT umani. Abstract in English Human BRAF-driven tumors are aggressive malignancies with poor clinical outcome and lack of sensitivity to therapies. TRAP1 is a HSP90 molecular chaperone deregulated in human tumors and responsible for specific features of cancer cells, i.e., protection from apoptosis, drug resistance, metabolic regulation, and protein quality control/ubiquitination. The hypothesis that TRAP1 plays a regulatory function on the BRAF pathway, arising from the observation that BRAF levels are decreased upon TRAP1 interference, was tested in human breast and colorectal carcinoma in vitro and in vivo. This study shows that TRAP1 is involved in the regulation of BRAF synthesis/ubiquitination, without affecting its stability. Indeed, BRAF synthesis is facilitated in a TRAP1-rich background, whereas increased ubiquitination occurs upon disruption of the TRAP1 network that correlates with decreased protein levels. Remarkably, BRAF downstream pathway is modulated by TRAP1 regulatory activity: indeed, TRAP1 silencing induces (i) ERK phosphorylation attenuation, (ii) cell-cycle inhibition with cell accumulation in G0–G1 and G2–M transitions. It is worth noting that TRAP1 regulation on BRAF is conserved in human colorectal carcinomas, with the two proteins being frequently coexpressed. The dual HSP90/TRAP1 inhibitor HSP990 showed activity against the TRAP1 network and high cytostatic potential in BRAF-mutated colorectal carcinoma cells. Therefore, this novel TRAP1 function represents an attractive therapeutic window to target dependency of BRAF-driven tumors on TRAP1 translational/quality control machinery. In addition, TRAP1 role in thyroid carcinoma (TC) progression, still unaddressed at present, was investigated by analyzing its expression in a cohort of 86 human TCs and evaluating its involvement in cancer cell survival and proliferation in vitro. Indeed, TRAP1 levels progressively increased from normal peritumoral thyroid gland, to papillary TCs, follicular variants of papillary TCs and poorly-differentiated TCs. Interestingly, anaplastic thyroid tumors exhibited a dual pattern, the majority being characterized by high TRAP1 levels, while a small subgroup completely negative. Consistently with a potential involvement of TRAP1 along thyroid tumor progression, TRAP1 silencing resulted in increased sensitivity to paclitaxel-induced apoptosis, inhibition of cell cycle progression and attenuation of ERK signaling. Noteworthy, the inhibition of TRAP1 ATPase activity by pharmacological agents resulted in attenuation of cell proliferation, inibition of ERK signaling and revertion of drug resistance. These data suggest that TRAP1 upregulation is involved in TC progression and its inhibition may be regarded as potential strategy to target specific fearures of human TCs, i.e., cell proliferation and resistance to apoptosis.