Dalla discovery del “Cancer Methylome” alla validazione di nuovi biomarkers epigenetici nelle neoplasie gastrointestinali

ABSTRACT (Italiano) Secondo l’attuale modello di cancerogenesi “epigenetico-staminale” i tumori originano da un insieme non solo di mutazioni genetiche ma di modificazioni epigenetiche a livello di geni che regolano le più disparate funzioni cellulari come proliferazione, differenziamento, apoptosi, stabilità genomica, angiogenesi, invasione e metastasi. Diversi studi hanno messo in evidenza che le modificazioni epigenetiche (metilazione del DNA; acetilazione/fosforilazione/metilazione/ubiquitinizzazione degli istoni; non-coding RNA, modificazioni conformazionali della cromatina) sono presenti sin dalle fasi più precoci della cancerogenesi, permettendo di individuare nuovi biomarkers di diagnosi, prognosi, follow-up e predizione di risposta alla terapia. Su questa linea di evidenze abbiamo condotto uno studio del “cancer methylome” con l’obiettivo di individuare nuovi target epigenetici. La fase iniziale di discovery è stato condotta mediante analisi dell’espressione di circa 49.000 geni con tecnologia microarray in 20 linee cellulari derivate da 5 diversi istotipi. Per mezzo di una strategia, messa a punto con il gruppo della JHU, di smascheramento farmacologico con l’ agente demetilante 5-aza-2’deossicitidina, è stato possibile selezionare 200 geni, 25 dei quali erano già noti per la loro metilazione tumore-specifica. 175 rappresentavano nuovi geni potenzialmente metilati. Di questi 175 geni, 82 risultavano metilati solo nelle linee cellulari, 53 anche nei tessuti primari di 14 istotipi diversi. Di questi 53 geni 28/53 presentavano una metilazione tumore-specifica, mentre 25 una metilazione tessuto-specifica. Dopo l’analisi high-throughput iniziale di discovery, abbiamo condotto uno studio di validazione di specifici target nelle neoplasie colon-rettali e del pancreas. Tra i geni metilati in maniera tumore-specifica abbiamo selezionato i seguenti geni: b4GalT1 per i tumori del colon (130 casi di adenocarcinoma del colon, 13 adenomi, and mucosa colica normale); KIF1A per l’ adenocarcinoma pancreatico (60 tumori e 10 campioni di parenchima normale). Il gene b4GalT1 presenta una sensibilità del 54% (95% CI: 35.1%–72.1%) e una specificità del 91.7% (95% CI: 74.1%–97.7%). I livelli di metilazione correlano in maniera inversa con i livelli di espressione dell’ mRNA, non sono state trovate correlazioni tra la metilazione e i dati di outcome clinico. Il gene KIF1A risulta invece metilato nell’81% degli adenocarcinomi 175 potentially novel methylated genes 25 known methylated genes Methylated in primary tissue 53/82 Cancer-specific methylation 28/53 Tissue-specific Methylation, 25/53 del pancreas ma non nel parenchima normale derivato da soggetti senza malattia neoplastica evidente. KIF1A presenta metilazione anche nelle lesioni preneoplastiche IPMN (Intraductal papillary mucinous neoplasm) suggerendo che la metilazione di questo gene può comparire già nella fasi più precoci del processo neoplastico. Diversi marcatori molecolari vengono continuamente proposti per una miglior definizione della diagnosi e della prognosi nel carcinoma del colon retto e del pancreas, ma la loro reale utilità rimane controversa spesso per la loro scarsa sensibilità e specificità. Il primo step nella pipeline di discovery di nuovi biomarcatori di screening richiede infatti uno studio del nuovo target nei tessuti tumorali e in quelli non tumorali per la definizione dei suddetti parametri. Pertanto alla luce dei risultati ottenuti i marcatori epigenetici di b4GalT1 e KIF1A rispettivamente ipermetilati in modo significativo nei tumori del colon e del pancreas, in funzione della loro elevata sensibilità e specificità possono essere considerati dei “candidate biomarkers” ottimali per lo studio di queste neoplasie e in particolare per ulteriori studi che ne permettano di definire il ruolo nella diagnosi precoce (screening) e nel followup (marcatori dei ripresa di malattia). ABSTRACT (Inglese) Solid human tumors arise and progress through aberrant function of various genes that positively and negatively regulate many aspects of cell function, including proliferation, apoptosis, genome stability, angiogenesis, invasion and metastasis. Studies in animals and in humans have demonstrated that these epigenetic changes are an early event in carcinogenesis and are present in the precursor lesions of a variety of cancers including colon and pancreatic lesions. In an effort to identify important tumor suppressor genes silenced by promoter methylation, in the first phase of the present study I have conducted a genome-wide promoter screening study, in collaboration with Dr. David Sidransky’s group (Johns Hopkins University), in cancer cell lines and 13 different tumor histotypes . The approach coupled probabilistic search algorithms in the entire human genome with an established pharmacologic unmasking strategy in cancer cell lines for unbiased and precise global localization of tumor-specific methylated genes. The computational approach followed by microarray analysis allowed to identify 200 genes predicted to be methylated. 25 were previously reported as harbouring cancer specific promoter methylation after a literature search. The remaining 175 genes were tested for promoter methylation by bisulphite sequencing (BS) or methylation-specific PCR (MSP) in one or more cell line that exhibited re-expression after demethylating treatment. Promoter methylation of 82 genes (82/175) (47%) was documented in cell lines based on identification of =50% methylated CpG sites in the CpG island. Out of 82 genes which showed methylation in cell lines, promoter methylation was detected in 53 (65%) genes in primary tumor tissues. After testing corresponding age matched normal tissues, 28 of these genes (28/175; 16%) were identified to be methylated in a cancer-specific manner. After the initial high-throughput discovery analysis, a high-resolution validation study on specific target has been conducted in colorectal and pancreatic cancer. Among cancer-specific methylated genes we selected b4GalT1 for colorectal cancer (130 colorectal adenocarcinomas, 13 adenomas, and normal tissue) and KIF1A for pancreatic adenocarcinoma (60 tumor samples and normal parenchyma). b4GalT1 resulted to have a 54% sensitivity (95% CI: 35.1%–72.1%) and a specificity of 91.7% (95% CI: 74.1%–97.7%). An inverse correlation was observed between methylation and B4GALT1 mRNA expression levels. Moreover significant differences in methylation levels and frequencies of B4GALT1 was demonstrated in invasive colorectal lesions as compared with normal mucosa (p = 0.0001) and in carcinoma samples as compared with adenoma (p = 0.009). KIF1A was also found to be specifically methylated in 81% of a pancreatic adenocarcinoma cases and not in normal parenchyma derived from cancer-free subject. Additionally KIF1A resulted to be methylated in IPMN (Intraductal papillary mucinous neoplasm) which are considered preneoplastic lesions, suggesting that methylation of this gene in pancreatic cancer may occur since the early phases. These results suggest that the B4GALT1 and KIF1A represent new and valuable candidate epigenetic biomarkers respectively of colorectal and pancreatic cancer.