Multi-integrated approach based on HPT-JT families for the identification of a set of biomarkers of Parathyroid Carcinoma

Background. As part of the Hyperparathyroidism with Jaw Tumor syndrome (HPT-JT), parathyroid carcinoma (KP) is caused by mutations of the CDC73 tumor suppressor gene, encoding the parafibromin, a PAF1 co-transcription factor, involved in chromatin remodelling and cell cycle regulation. Mutations of MEN1 gene cause the namesake syndrome (MEN1), in whose parathyroid lesions are benign in 99% of cases: instead, in the last 40 ys, only 15 cases worldwide have been reported with the unusual association of KP in MEN1 syndrome. KP is a rare, aggressive life-threatening tumor for whose at the present current therapies resulted ineffective and the surgical removal of the lesion remains the only curative approach. However, to recognize in first diagnosis a malignant parathyroid lesion from an indolent hyperplasia or benign adenoma still represents a challenge, in absence of pathognomic signs, such as distant metastasis or local recurrences. So far, unsuccessful efforts have been made in search of clinical biomarkers that could address to the (best) surgery option (conservative/demolitive) in order to reduce the risk of recurrence and to extend the disease free survival. Purpose and methods. The present project aims to identify the genetic causes leading to the development of a parathyroid carcinoma (KP) and to detect a set of biomarkers for a possible unequivocal, early first diagnosis. We decided to apply high throughput strategies such Whole Exome Sequencing (WES) and Expression Profiling (EP) to familial cases (consisting of one or more affected subjects, non-affected carriers and healthy controls with the same genetic background) rather than to sporadic ones in order to, possibly, reduce the intrinsic variability caused by different genetic backgrounds. Our rare cohort consisted of 5 HPT-JT families with malignant parathyroid lesion and constitutional mutation of the CDC73 gene and a very rare family with MEN1 mutation associated with recurrent and familial KP. Results.WES analysis revealed that in 4 (out of 5) HPT-TJ families, surprisingly, only the affected subjects shared rare variants (MAF < 0.004) in genes encoding the integrins (ITGA3, ITGA2B, ITGA11, ITGAB6, ITGA9), cell surface receptors involved in cell adhesion to the extracellular matrix (ECM) and essential for proliferation, survival, adhesion and migration of cells. Moreover, other variants in genes encoding proteins involved in DNA repair such as FANCC and BRIP1; NOTCH4; RET; BRCA1; BLK; MUC12; KMT2C; Hedgehog target genes such as SMO, GLI3 were identified. Finally a variant in GLI2 gene was found inaffected subjects of MEN1- KP family. The EP analysis compared the affecteds vs controls between HPT-JT families and the unique MEN1-KP family. The analysis showed a differential expression of genes of immune system. The EP also evidenced that MEN1 and HPT-JT patients use different set of genes to control the calcium mobilization. Functional assay. Human embryonic kidney (HEK293) cell lines were transfected with eukaryotic expression vectors carrying WT or mutated CDC73 gene: 5 different mutations weretested in presence/absence of Bortezomib, a drug already used in clinic for the therapy of multiple mieloma. We proved that this proteasome inhibitor was able to partially rescue the expression of missense, inframe and even frameshift CDC73 gene deletions. Conclusions and perspectives. This preliminary project may help to find a biomarkers set for a prompt early diagnosis of KP, in order to suggest the best surgical approach and identify asymptomatic carriers in affected families for an efficient early intervention. We suppose that the onset/progression/aggressivity of KP may be due to the deregulation of proteins involved in cell-cell adhesion (such integrins); the derangement of immune system; the deregulation of the Hedgehog pathway and the lack of trigger factors, such as the proteins assigned to DNA integrity (FANCC, BRIP1, BRCA1). Finally we reported, for the first time, the possible use of a well known chemotherapy drug, the Bortezomib, for the therapy of KP CDC73 induced, taking into account that, so far, all the attempts to find an efficient drugs as alternative approach to the surgery, resulted ineffective.

Introduzione. Nella sindrome da iperparatiroidismo associato a tumore della mandibola (HPT-JT), il carcinoma paratiroideo (PC) è causato da mutazioni del gene oncosoppressore CDC73 codificante per parafibromina, un componente del complesso PAF1 coinvolto nel rimodellamento della cromatina e nella regolazione del ciclo cellulare. Le mutazioni del gene MEN1 causano la sindrome omonima (MEN1), le cui lesioni paratiroidee sono benigne nel 99% dei casi ma, negli ultimi 40 anni, sono stati riportati 15 casi di associazione insolita fra PC e la sindrome MEN1 nel mondo. Il PC è un tumore raro e aggressivo per il quale le attuali terapie sono risultate inefficaci e l'asportazione chirurgica della lesione rimane l'unico approccio curativo. Tuttavia, la distinzione in prima diagnosi fra una lesione paratiroidea maligna e un’ iperplasia indolente o un’adenoma benigno rappresenta ancora oggi una sfida, in assenza di segni patognomici, come metastasi a distanza o recidive locali. Finora, sono stati compiuti sforzi infruttuosi per la ricerca di biomarcatorimolecolari che potessero indirizzare verso il (migliore) trattamento chirurgico (conservativo/demolitivo) al fine di ridurre il rischio di recidiva e di estendere la sopravvivenza libera da malattia. Scopo del progetto e metodi. Questo progetto mira a identificare le cause genetiche che portano allo sviluppo di un carcinoma paratiroideo (PC) e a individuare una serie di biomarcatori utili per una inequivocabile e precoce diagnosi di PC. A tal fine sono state applicate strategie di Next Generation Sequencing, quali il sequenziamento dell’ intero esoma e studi di espressione genica, a casi familiari (costituiti da uno o più soggetti affetti, portatori non affetti e controlli sani con lo stesso background genetico) piuttosto che a casi sporadici al fine di ridurre, per quanto possibile, la variabilità intrinseca causata dai diversi background genetici. La nostra rara coorte consta di 5 famiglie con HPT-JT e lesione paratiroidea maligna e mutazione costituzionale del gene CDC73 e una famiglia molto rara con mutazione MEN1 associata a PC. Risultati. Il sequenziamento dell’intero esoma ha mostrato che solo i soggetti affetti di 4 (delle 5) famiglie con HPT-JT reclutate per lo studio, condividono varianti rare (MAF <0,004) in geni codificanti per le integrine (ITGA3, ITGA2B, ITGA11, ITGAB6, ITGA9), recettori di superficie coinvolti nell'adesione cellulare alla matrice extracellulare (ECM) ed essenziali per la proliferazione, la sopravvivenza, l'adesione e la migrazione delle cellule. Inoltre sono state identificate ulteriori varianti nei geni che codificano per proteine coinvolte nel riparo del DNA come FANCC e BRIP1; NOTCH4; RET; BRCA1; BLK; MUC12; KMT2C; geni target della pathway di Hedgehog quali SMO, GLI3, mentre una variante del gene GLI2 è stata identificata solamente nei soggetti affetti della famiglia MEN1 associata a PC. Lo studio dell’ espressione genica è stato condotto confrontando i pazienti affetti vs controlli fra le famiglie con HPT-JT e l'unica famiglia MEN1-PC. L’ analisi effettuata ha mostrato un'espressione differenziale dei geni del sistema immunitario e inoltre ha evidenziato che i pazienti MEN1 e HPT-JT utilizzano diversi set di geni per controllare la mobilizzazione del calcio. Saggi funzionali. Cellule HEK293 sono state trasfettate con vettori di espressione codificanti la forma WT o mutata del gene CDC73: sono state testate 5 diverse mutazioni in presenza/assenza di Bortezomib, un farmaco già utilizzato in clinica per la terapia del mieloma multiplo. Questo inibitore del proteasoma sembra essere in grado di recuperare parzialmente l'espressione di proteine CDC73 mutate a causa di mutazioni missenso, in-frame e persino frameshift. Conclusioni e prospettive. Questo progetto, seppur preliminare, può aiutarci ad identificare biomarker utili per una diagnosi precoce e immediata di PC al fine di indirizzareverso il miglior approccio chirurgico e identificare i portatori asintomatici nelle famiglie affette per un intervento precoce ed efficace. Ipotizziamo che l'insorgenza/progressione/aggressività del PC possa essere dovuta alla deregolazione di proteine coinvolte nell'adesione cellula-cellula (come le integrine); allo squilibrio nell’ attivazione del sistema immunitario; alla deregolazione della pathway di Hedgehog e alla perdita di fattori scatenanti, come le proteine implicate nel mantenimento dell'integrità del DNA (FANCC, BRIP1, BRCA1). Infine, considerando che la ricerca di un farmaco efficace come approccio alternativo al trattamento chirurgico è risultata fino ad oggi vana, per la prima volta, riportiamo il possibile utilizzo di un farmaco chemioterapico ben conosciuto, il Bortezomib, per la terapia del PC dovuto a mutazioni del gene CDC73.