Genetics, mycotoxins and diagnostics of Fusarium species involved in Fusarium Head Blight of cereals, with particular attention to Fusarium graminearum, for a higher quality and safer cereal production

I cereali rappresentano l’alimento base per molte persone a livello mondiale. Tra le malattie, la Fusariosi dei Cereali o Fusarium Head Blight (FHB) è una delle più preoccupanti nei cereali ed è causato da diverse specie di Fusarium. La comprensione della struttura della popolazione della fusariosi è importante perché la colonizzazione può differire tra le specie di Fusarium e ognuno di esse può avere il suo profilo di micotossine. Pertanto, un'identificazione affidabile delle specie più presenti è importante per la corretta valutazione del potenziale rischio tossicologico dei cereali contaminati. Fusarium graminearum sensu stricto (s. s.) è l'agente principale della Fusariosi ed è membro del complesso di specie F. graminearum species complex (FGSC) composto da 16 entità filogenetiche. Tra le più importanti micotossine di Fusarium ci sono i tricotecani, potenti inibitori della sintesi proteica. Ogni specie del complesso FGSC è in grado di produrre tricoteceni di tipo B in planta. In particolare, il deossinivalenolo (DON), il nivalenolo (NIV) e i loro derivati acetilati (3-ADON, 15-ADON e 4-ANIV) sono le micotossine più comuni prodotte dalle specie del complesso. Nel nostro studio, 361 campioni di cereali raccolti in Austria, Germania e Cina durante un periodo di tre anni (2011-2013) sono stati analizzati per le specie di Fusarium e la relativa contaminazione da micotossine. Tra i campioni raccolti in Cina, la micotossina più frequente è stata l’enniatina B1 (94% di campioni contaminati) e F. graminearum s. s. è stata la specie più frequentemente isolata. In Germania e Austria la beauvericina (BEA), l’enniatina (ENNs), il DON e deossinivalenol-3- glucoside (D3G) sono state le micotossine più rilevate. Quì, su orzo e frumento, F. graminearum s. s., F. poae e specie appartenenti al clade di F. tricinctum erano le specie più presenti identificate; d'altra parte, F. subglutinans e F. temperatum erano le specie più presenti sul mais. Inoltre, sono stati raccolti e analizzati 208 campioni da aree geografiche dell'Italia per un periodo di tre anni (2013-2015) e le analisi chimiche hanno rivelato la contaminazione della tossina zearalenone (ZEA) nella maggior parte dei campioni, tricoteceni di tipo B (DON e NIV) in campioni raccolti in Piemonte, Emilia-Romagna, Marche, Toscana e Puglia, tricoteceni di tipo A (T-2 e HT-2) nell'Italia meridionale. È stata caratterizzata la diversità filogenetica di una popolazione mondiale di 92 ceppi di F. graminearum isolati su 5 diversi cereali, grano, orzo, mais, avena e triticale. L'identificazione basata sulla sequenza del DNA e l'analisi filogenetica dei geni β-tubulina e del fattore di elongazione-1α hanno dimostrato che 14 ceppi isolati dal grano raccolto in Cina erano strettamente correlati al ceppo di riferimento di F. gerlachii, specie mai trovata prima su grano cinese. Tutti gli altri ceppi della popolazione isolati in Austria, Germania, Cina e Italia sono stati identificati come F. graminearum s. s. Test di PCR convenzionali, uno di letteratura e uno sviluppato in questo studio per l'individuazione di un nuovo tipo di tricotecene A, NX-2, di recente scoperto, sono stati utilizzati per determinare il genotipo dei tricoteceni degli isolati, allo scopo di studiare la distribuzione di questi in differenti aree geografiche. Le analisi molecolare eseguite sui ceppi italiani di F. graminearum s. s. hanno confermato che il 15-ADON è l'unico chemeotipo osservato e tutti i 14 ceppi identificati come F. gerlachii hanno mostrato il chemiotipo molecolare 3-ADON. Tutta la popolazione analizzata non ha l'allele del gene TRI1 per la produzione del nuovo NX-2. L'assenza del chemotipo 3-ADON tra i ceppi italiani mostrato nello studio è una importante informazione per la situazione italiana, in quanto il chemiotipo 3 ADON è noto essere il più aggressivo sulle piante di frumento. Inoltre, sono state effettuate analisi chimiche per rilevare la reale capacità di produrre tricoteceni e queste hanno confermato la massima produzione di 15 ADON da parte dei ceppi identificati come F. graminearum s. s. e hanno rilevato sia chemiotipo NIV che DON per tutti e 14 i ceppi di F. gerlachii. In conclusione, il nostro lavoro ha fornito una relazione dettagliata sulla popolazione mondiale di F. graminearum da cereali, principalmente grano. Un altro importante concetto di questa tesi è la quantificazione della biomassa delle specie di Fusarium contaminanti le piante di frumento in differenti fasi fenologiche, indispensabile per comprendere l'interazione tra le singole specie fungine e le piante nello sviluppo delle malattie. In questo studio sono state effettuate due prove diverse in fitotrone, su piante di frumento duro inoculate artificialmente con sospensioni di F. graminearum e F. culmorum, in diverse fasi di crescita vegetale. Le piante sono state campionate in differenti fasi di crescita e tagliate in diverse parti. Sono stati testati complessivamente 64 campioni di frumento inoculati con F. graminearum e 64 con F. culmorum. Sono stati eseguiti due differenti test quantitativi in real-time PCR per rilevare il DNA di F. graminearum e F. culmorum sui campioni di frumento. Un test quantitativo di PCR basato sul gene di elongazione-1α, usando il SYBR Green, è stato utilizzato per rilevare F. culmorum. Un test TaqMan è stato utilizzato per rilevare F. graminearum, con primers e sonda costruiti su un frammento di DNA specifico per F. graminearum. Inoltre, sono state effettuate analisi chimiche su un insieme di campioni di grano, al fine di rilevare la quantità di DON, una tossina di solito associata a F. graminearum e F. culmorum. La presenza di F. graminearum è stata rilevata sulle spighe e sulle cariossidi di tutte le piante inoculate alla fioritura, considerata lo stadio chiave per la contaminazione della cariosside da parte di Fusarium; d'altra parte, la presenza di F. culmorum è stata rilevata solo in campioni inoculati e campionati allo stesso tempo, senza diffusione dopo l'inoculo. DON è stato rilevato anche in campioni con scarsa quantità o assenza del fungo, vista la sua capacità di muoversi nel sistema vascolare; mentre DON non è stato rilevato nelle cariossidi. Oltre alle micotossine già menzionate, l'acido fusarico (FA) è tra i più antichi metaboliti secondari identificati prodotti dalle specie di Fusarium, noti per lungo tempo mostrare una forte fitotossicità e una tossicità moderata alle cellule animali; tuttavia, gli obiettivi cellulari di FA e la sua funzione nella patogenicità fungina rimangono sconosciuti. Quì abbiamo esaminato il ruolo di FA in F. oxysporum, un patogeno che provoca appassimento vascolare su più di cento specie vegetali e infezioni opportunistiche nell'uomo. La delezione mirata di fub1, che codifica per un ortologo della polichetide-sintesi coinvolta nella biosintesi di FA in F. verticillioides e F. fujikuroi, ha abolito la produzione di FA e dei suoi derivati in F. oxysporum. Inoltre abbiamo dimostrato che l'espressione di fub1 è controllata dal regolatore principale del metabolismo secondario LaeA, attraverso la modulazione dell'accessibilità della cromatina al locus fub1. La FA ha mostrato una forte fitotossicità sulle piante di pomodoro, attenuata da un rifornimento esogeno di rame o zinco, suggerendo una possibile funzione di FA come agente chelante di questi due ioni metallici. È importante notare che la gravità dei sintomi vascolari sulle piante di pomodoro e la mortalità dei topi immunodepressi sono stati significativamente ridotte nei mutanti fub1Δ e completamente ripristinate nei ceppi complementari. Insieme, questi risultati forniscono nuove conoscenze sulla regolazione e sul modo di azione del FA così come sulla funzione di questa fitotossina durante il processo di infezione di F. oxysporum