Development of innovative systems for the identification and monitoring of Listeria Monocytogenes in fresh-cut products

Abstract The foodborne pathogen Listeria monocytogenes is the causative agent of listeriosis, a severe disease with high hospitalization and case fatality rates. L. monocytogenes can survive and grow over a wide range of environmental conditions. This allows the pathogen to overcome food preservation and safety barriers, and pose a potential risk to human health. For these reasons, a fast detection and quantification of the pathogens are key points to ensure the safety of the consumers. The official recommended methods to detect L. monocytogenes in foods are carried out by culture-dependent methods, while the Most Probable Number (MPN) method is generally used to enumerate L. monocytogenes at low concentrations. These conventional methods are laborious and may require 5-10 days to confirm a positive results, a time that goes beyond the shelf life of the product itself. In this temporal space, packaging and storage conditions of minimally processed vegetables and fruits may encourage the growth of this psychrotrophic pathogen making it necessary the development of alternative methods of monitoring and controlling of L. monocytogenes in fresh-cut products. In the present work we integrated conventional MPN technique with qPCR, in order to keep the advantages of both methods, sensitivity of MPN and reliability and quickness of qPCR. Moreover, we developed a qPCR enrichment-based method for a fast and reliable detection of L. monocytogenes in minimally processed vegetables. In order to validate the proposed technique, the results were compared with conventional culture-dependent methods. Finally, probiotic Lactobacillus spp. were investigated for their antagonistic effect against Listeria monocytogenes on fresh-cut pineapple pieces. By the proposed molecular-baesd approach we are able to quantify L. monocytogenes in artificially contaminated fresh-cut vegetables at an initial concentration of 1 cfu g-1 in 48 hours. QPCR alone allowed a limit of detection (LOD) of 101 CFU g-1 after 2 hours of enrichment in a selective medium. In addition, the occurrence of the pathogenic bacteria in mixed salad samples and fresh-cut melons was monitored in two production plant from the receipt of the raw materials to the early stages of shelf life. No sample was found to be contaminated by L. monocytogenes. The antagonistic assays indicated that Lactobacillus fermentum and Lactobacillus plantarum were able to inhibit the growth of L. monocytogenes on pineapples pieces along conservation, being L. plantarum more effective than L. fermentum. The reported results suggest that molecular methods could integrate conventional methods for a faster detection of foodborne pathogens in fresh-cut vegetables. In addition, we proposed two new probiotic strains that could be successfully applied during processing of fresh-cut pineapples, contributing at the same time to inducing a protective effect against a relevant foodborne pathogen, such as L. monocytogenes. Abstract (Italian) Listeria monocytogenes è un patogeno di origine alimentare ed è l’agente eziologico della listeriosi, una grave affezione con elevato tasso di ospedalizzazione e di mortalità. L. monocytogenes può sopravvivere e crescere in un ampia gamma di condizioni ambientali. Ciò permette al patogeno di superare gli ostacoli imposti dalle esigenze di conservazione e sicurezza alimentare, rappresentando un rischio potenziale per la salute umana. Per questi motivi, il rapido rilevamento e la quantificazione del patogeno sono punti chiave per garantire la sicurezza dei consumatori. I metodi ufficiali che sono raccomandati per il rilevamento di L. monocytogenes negli alimenti sono considerati metodi coltura-dipendenti, mentre il metodo del numero più probabile (MPN) è generalmente usato per quantificare L. monocytogenes a basse concentrazioni. Questi metodi convenzionali sono complessi e possono richiedere 5-10 giorni per confermare un risultato positivo, un tempo che è superiore alla conservabilità del prodotto stesso. In questo spazio temporale, le condizioni di confezionamento e conservazione di frutta e verdura di IV gamma possono favorire la crescita di questo patogeno psicrotrofico, rendendo necessario lo sviluppo di metodi alternativi di monitoraggio e di controllo di L. monocytogenes nei prodotti minimamente processati. Nel presente lavoro la tecnica MPN convenzionale è stata integrata con la real-time PCR quantitativa (qPCR) al fine di mantenere i vantaggi di entrambi i metodi: sensibilità del MPN e affidabilità e rapidità della qPCR. Inoltre, è stato sviluppato un metodo basato sulla qPCR dopo arricchimento selettivo per la rilevazione rapida e affidabile di L. monocytogenes negli ortaggi di IV gamma. Per validare la tecnica proposta, i risultati sono stati confrontati con i convenzionali metodi coltura-dipendenti. Infine, probiotici Lactobacillus spp. sono stati studiati per il loro effetto antagonista contro Listeria monocytogenes su pezzi di ananas fresh-cut. Con l'approccio molecolare proposto è stato possibile quantificare la presenza di L. monocytogenes in prodotti di IV gamma contaminati artificialmente ad una concentrazione iniziale di 1 cfu g-1 in 48 ore. La tecnica qPCR ha consentito un limite di rilevabilità (LOD) di 101 CFU g-1 dopo 2 ore di arricchimento in terreno selettivo. Inoltre, la presenza di L. monocytogenes in campioni di insalata mista e meloni di IV gamma è stata monitorata in due impianti di produzione dal momento del ricevimento delle materie prime alle prime fasi della shelf-life. Nessun campione era contaminato da L. monocytogenes. Gli esperimenti di antagonismo hanno mostrato che Lactobacillus fermentum e Lactobacillus plantarum erano in grado di inibire la crescita di L. monocytogenes su ananas di IV gamma durante il periodo di conservazione, essendo L. plantarum più efficace di L. fermentum. I risultati riportati suggeriscono che i metodi molecolari potrebbero integrare i metodi convenzionali per la rilevazione rapida di agenti patogeni di origine alimentare nelle verdure di IV gamma. Inoltre, sono stati proposti due nuovi ceppi probiotici che potrebbero essere applicati con successo durante l'elaborazione di ananas di IV gamma, contribuendo allo stesso tempo ad indurre un effetto protettivo nei confronti di un importante patogeno alimentare quale L. monocytogenes.